Transkriptom-Analyse von Einzelzellen
Summary
In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Methode für die Gewinnung von Einzelzellen aus der Ratte primären neuronalen Kulturen und anschließende Transkriptom-Analyse mit aRNA Verstärkung. Dieser Ansatz ist verallgemeinerbar zu jedem Zelltyp.
Abstract
Viele Genexpressionsanalyse Techniken beruhen auf Material aus heterogenen Populationen von Zellen aus dem Gewebe-Homogenate oder Zellen in Kultur isoliert. 1,2,3 Im Fall des Gehirns, Regionen wie der Hippocampus eine komplexe Anordnung von verschiedenen Zelltypen enthalten, die jeweils mit verschiedene mRNA-Profilen. Die Möglichkeit, einzelne Zellen Ernte ermöglicht eine genauere Untersuchung der molekularen Unterschiede zwischen und innerhalb von Zellpopulationen. Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode zur Ernte-Zellen für die weitere Verarbeitung. Pipetten oft in Elektrophysiologie werden eingesetzt, um zu isolieren (mit Aspiration) eine Zelle von Interesse und bequem hinterlegen sie in ein Eppendorf-Röhrchen für die weitere Verarbeitung mit einer beliebigen Anzahl von Techniken der Molekularbiologie. Unser Protokoll kann für die Ernte von Dendriten aus Zellkultur oder sogar einzelne Zellen aus akuten Scheiben geändert werden.
Wir beschreiben auch die aRNA Amplifikationsmethode als wichtiger nachgeschalteten Anwendung der einzelnen Zelle Isolierungen. Diese Methode wurde zuvor von unserem Labor als Alternative zu anderen Genexpressionsanalyse Techniken wie Reverse-Transkriptase-oder real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entwickelt. 4,5,6,7,8 Diese Technik sorgt für lineare Verstärkung des polyadenyliert RNA Anfang mit nur Femtogramm des Materials und die daraus resultierende in Mikrogramm-Mengen von Antisense-RNA. Die linear verstärkte Material bietet eine genauere Schätzung als PCR exponentielle Vermehrung der relativen Häufigkeit von Komponenten der Transkriptom der isolierten Zellen. Das grundsätzliche Vorgehen besteht aus zwei Runden Verstärkung. Kurz gesagt, ist ein T7-RNA-Polymerase-Promotor site in doppelsträngigen cDNA aus der mRNA-Transkripte erstellt eingearbeitet. Eine Übernachtung in vitro-Transkription (IVT) Reaktion wird dann durchgeführt, in dem T7-RNA-Polymerase produziert viele Antisense-Transkripte von der doppelsträngigen cDNA. Die zweite Runde wiederholt diesen Vorgang aber einige technische Unterschiede, da das Ausgangsmaterial Antisense-RNA. Es ist Standard in die zweite Runde zu wiederholen, was in drei Runden der Amplifikation. Oft ist die dritte Runde in vitro Transkriptions-Reaktion unter Verwendung von biotinylierten Nucleosidtriphosphate, so dass die Antisense-RNA hergestellt hybridisiert werden können und erkannt auf einem Mikroarray. 7,8
Protocol
Discussion
Hinweise und Problembehandlung
- Sie können vor und nach Bildern, die zeigen, dass die Zielzelle isoliert wurde und dass die verbleibenden Penumbra wurde unberührt gelassen zu nehmen.
- Wenn zu viel Lösung geht in die Pipette, wie Sie ernten, können Sie 3-Wege-Luer-Lock Armaturen und den Kolben der Spritze bis Überdruck in der Leitung zu halten. Die gewünschte Lautstärke wird mit der Art der Verarbeitung variieren, aber bis zu 5 ul sollte für die meisten Anwendungen gut.
Allgemeine Tipps molekularbiologischen Techniken
- Vortex alle Lager Rohre und Spin sie nieder, bevor es zu einer Reaktion. NEVER Wirbel Enzyme.
- Gründlich mischen Reaktionen vor Zugabe des Enzyms, um sicherzustellen, dass der Puffer in der richtigen Konzentration ist.
- Keep Enzym Aktien bei -20 ° C, wenn möglich mit einem stratacooler. Ansonsten, direkt vor dem Gebrauch zu entfernen, halten Sie auf dem Eis, und kehren sofort auf -20 ° C.
- Achten Sie immer Mastermixen bei der Vorbereitung mehr als eine Reaktion auf Pipettieren Fehler zu reduzieren. Berechnen Sie das erforderliche Volumen auf Basis der Anzahl der Proben und fügen 10-20%.
- Shop-RNA bei -80 ° C zu verzögern Abbau. RNA ist sehr stabil gelagert in einem Puffer zu verzögern apurination von RNA, die in sauren Bedingungen auftritt.
Grundzüge des aRNA Procedure
Abbildung 4A zeigt die erste Runde der aRNA Verfahren. In den ersten Strang Reaktion, wählt der Poly-T Teil des T7-Oligo (dT) Primer für mRNA-Spezies (lange weiße Rechteck) durch Bindung an die polyA Schwanz. Einige microRNAs sind auch polyadenyliert und wird durch dieses Verfahren erfasst werden. Vor allem aber wird die am häufigsten vorkommende RNAs in der Zelle, ribosomale RNAs, nicht. Diese Oligo dient als Primer für Reverse Transkriptase mit einem komplementären Strang der cDNA (langes graues Rechteck) zu synthetisieren mit der mRNA als Vorlage. Die T7 Teil des T7-Oligo (dT)-Primer enthält die T7-RNA-Polymerase-Promotor in Frame mit der Sequenz antisense an den Start mRNA. Dies wird später in der in vitro Transkriptions-Reaktion eingesetzt.
Anschließend wird die mRNA in die mRNA / DNA-Hybrid in den vorangegangenen Schritt erstellt teilhydrolysierte durch RNase H schaffen RNA "Primer" (kleine weiße Rechtecke) ähnlich wie die Okazaki-Fragmente in den rückständigen DNA-Synthese erstellt. DNA-Polymerase I benutzt die RNA-Fragmente prime DNA-Synthese mit dem DNA komplementär zur mRNA als Vorlage. Wenn es das nächste RNA-Fragment, dessen 5 erreicht 'nach 3' Nuklease-Aktivität entfernt die Ribonukleotiden und ersetzt sie durch Desoxyribonukleotiden. DNA-Ligase zugesetzt wird, um alle Stränge, wo der Austausch der führenden Stranges ist nicht vollständig unterbinden. T4-DNA-Polymerase hinzugefügt wird, um in den Bereichen zu füllen, wo RNA-Fragmente als erste Primer für die DNA-Polymerase I zu schaffen diente eine blunt-ended doppelsträngigen cDNA, die dann vor der Durchführung des IVT Reaktion gereinigt.
In der IVT Reaktion bindet T7-RNA-Polymerase, die T7-Promotors in der doppelsträngigen cDNA synthetisiert und Antisense-RNA-Moleküle (lange schwarze Rechtecke) mit der Sense-Strang als Vorlage aufgenommen. Dies dient als Verstärkung Schritt, in dem Tausende von Antisense-RNA-Moleküle aus jedem doppelsträngigen cDNA-Moleküls (Abbildung 4A) hergestellt werden.
Die zweite Runde, wie in Abbildung 4B dargestellt, beginnt mit einem Reverse-Transkriptase-Reaktion, die ein wenig anders als in der ersten Runde, da die Ausgangs-RNA ist antisense (durchgezogene schwarze Rechteck) und es fehlt die polyadenyliert Schwanz, der von der T7-oligo gezielte wurde (dT)-Primer in der ersten Runde. Daher ist diese Reaktion mit Random-Primern (kleine graue Rechtecke) und die RNA anschließend denaturiert grundiert. Der zweite Strang Reaktion wird dann durch die T7-Oligo (dT)-Primer, die den Poly-A-Sequenz bindet an das 3'-Ende des Sense-RNA in den vorangegangenen Reaktion der reversen Transkription erstellt grundiert. Ein weiterer IVT Reaktion ist in der gleichen Weise wie in der ersten Runde durchgeführt. Diese zweite Runde ist in der Regel mindestens einmal auf drei Runden der Amplifikation aus einer einzigen Zelle zu erreichen wiederholt.
Anwendungen
Die Techniken, die wir in diesem Artikel vorgestellt haben, können in eine Vielzahl von Anwendungen übersetzt werden. Die Einzelzellisolierung Protokoll kann für den Einsatz in akuten Schnitten geändert werden. 14 Obwohl technisch anspruchsvoll, die gleichen Prinzipien in dieser alternativen Zubereitung gelten. Außerdem, wenn die Größe der Pipette leicht angepasst ist, kann Aufnahmen der Physiologie der Zellen vor der Ernte was eine gut kontrollierte Untersuchung der molekularen Mechanismen hinter physiologischen Ausgänge erfolgen. Eine weitere kleine Änderung ist es, Prozesse aus der Zelle soma isolieren. 15 Für diese Anwendung zu sammeln Zellkörper mit einer Pipette und dann wieder mit einer frischen Pipette und sammeln 100-300 identifiziert dendrites oder Axonen pro Sammelrohr. 16
Sobald Zellen wurden geerntet, Vergleiche von mRNA Abundanzen und Kompositionen zwischen verschiedenen und sogar innerhalb der gleichen Zellpopulationen vorgenommen werden können. Die Einbeziehung biotinylierten-UTP in die dritte Runde aRNA ermöglicht Microarray-Analyse, um diese relative mRNA Häufigkeiten zu bestimmen. Die Zusammensetzung des ursprünglichen mRNA-Population kann auch nach dem aRNA Verfahren unter Verwendung der nächsten Generation Sequenzierung bestimmt werden. Das verstärkte aRNA kann auch verwendet werden, um Zellphänotyp Umwandlung Studien, in denen eine ganze Reihe von mRNAs aus einem Zelltyp in einen anderen Zelltyp transfiziert werden, um den Übergang von der Phänotyp des letzteren Zelltyp, in dem der ehemalige induzieren zu bestätigen, ein Verfahren, durch das Labor entwickelt und bekannt als Tiper. 17 Diese Studien sind besonders nützlich für die Untersuchung Krankheitsstadien und Zellphänotypen und solche Studien sind derzeit in den Labors. RT-PCR oder qPCR können auf das verstärkte Material durchgeführt werden, um die Expression von Zell-spezifische Gene zu bestätigen. Zusätzlich können Auswertungen der Effizienz der Transfektion oder Transduktion in der einzelnen Zelle Ebene getroffen werden.
Vorteile und Einschränkungen
Wie in der abstrakten gesagt, eliminiert Isolierung einzelner Zellen für die Analyse der Mittelung Effekte mit der Analyse von heterogenen Zellpopulationen zu sehen. Diese Mittelung Effekte falsch mRNA Häufigkeiten innerhalb einer einzigen Zelle, die durch über-repräsentiert reichlich Transkripte und Mittelung und die Verhinderung Detektion von vielen Low-Fülle-Transkripte. Die Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um einzelne Zellen zu sortieren, aber diese Methode erfordert die Kenntnis der Zell-spezifische Marker und teure Ausrüstung. 18 Laser Mikrodissektion entweder mit UV-oder IR-Laser Mikrodissektion Systeme erlauben einzelne Zelle und sogar subzelluläre erfassen, erfordert aber Zellen von Interesse zu an der Oberfläche sehr dünne Schnitte entfernt werden. 19 Ähnliche um Durchflusszytometrie, Laser-Mikrodissektion auch teure Ausrüstung erforderlich.
Einer der wichtigsten Vorteile der Elektrode basiert Sammlung oben beschriebene Technik ist, dass wertvolle elektrophysiologische Daten können aus der Zelle von Interesse vor der Ernte erzielt werden, so dass für Funktions-und Transkriptom-Analyse auf der gleichen Zelle durchgeführt werden. 20 A Kehrseite unserer Technik ist dass es erfordert Erfahrung im Umgang mit Mikromanipulatoren. Die Ermittler kennen Mikromanipulatoren finden diese Technik sehr intuitiv, aber Personen, die keine solche Erfahrung benötigen, um sich mit den feinen Bewegungen erforderlich.
Inherent in jedem Verstärkung Technik ist die bevorzugte Verstärkung bestimmter Transkripte nach Größe und Nukleotid-Zusammensetzung. 4,6,7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Techniken wie Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und Rapid Amplifikation von cDNA Enden (RACE) resultieren in exponentiellen Amplifikation der Transkripte, während die aRNA Verstärkung Vorgehen führt in lineare Verstärkung. So liegt einer der großen Vorteile der aRNA Verfahren in seiner Fähigkeit, besser zu bewahren die relativen Häufigkeiten der mRNA-Transkripte von nur linear verstärken etwaige Fehler oder Verzerrungen, die in der Verstärkung auftreten als exponentiell verstärkt gegen diesen Fehlern und Verzerrungen.
Die aRNA Verfahren mit Microarray-Analyse gekoppelt ermöglicht einen Vergleich der mRNA Abundanzen zwischen einzelnen Zellen mit gleicher oder unterschiedlicher Morphologie, behandelt oder unbehandelt. Darüber hinaus können verstärkt Material für die Sequenzierung der nächsten Generation eingereicht werden. 5,8 Aber Vorsicht ist bei solchen Analysen, da im Gegensatz zu der Verwendung von Random-Primer für das Verfahren, die Oligo-dT grundiert Verfahren über Vorurteile Verstärkung der beschriebenen genommen werden 3 'Enden der mRNA und führt in der Regel leichte Verkürzung der anschließenden verstärkt Material mit jeder Runde. Es sollte bei der Analyse von Microarray-Ergebnisse mit Standard-Methoden, da einige falsche abwesenden Anrufe aus leicht gekürzt amplifizierten Materials entstehen können übernommen werden. Darüber hinaus, während die Sequenzierung Ergebnisse werden in der Tat bieten die volle 5 'Sequenz die meisten der ursprünglichen mRNA, die 5' können Sequenzen von einigen mRNA entgehen lassen. Aus diesen Gründen sollte die Anzahl der Runden Verstärkungen begrenzt werden.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ihnen, Kevin Miyashiro für die Beschichtung und Pflege von Zellkulturen, Dr. Terri Schochet für die Bereitstellung von Zellkulturen für die Bilder in diesem Dokument enthalten. Darüber hinaus Dankeschön an Kevin Miyashiro, Dr. Peter Buckley, und Tiina Pertiz für die Eingabe über die aRNA Verfahren. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom National Institute on Aging, National Institute on Mental Health und der Human Resources Fact Finder Mitteln aus dem Commonwealth of Pennsylvania.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Spiegelgas coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | ||
| Nunc 35×10 mm culture dishes | Fisher | 12-565-90 | ||
| Water for cell culture | Lonza | 17-724Q | For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips | |
| Poly-D-Lysine MW70-150K | Sigma | 6407 | ||
| Laminin, ultrapure | BD Bioscience | 354239 | ||
| Boric acid | Sigma | B0252 | ||
| MEM with Earle’s salts and glutamax | Invitrogen | 41090-101 | For plating cells | |
| D-glucose | Sigma | G8769 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | ||
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma | C1768 | ||
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Invitrogen | 11095-098 | For growing cells | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
| Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) | Kimble Chase | 34500 99 | Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. | |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+) | |
| 1ml syringe | BD | 309628 | ||
| Needle | BD | Gauge depends on the diameter of the pipettes | ||
| dNTP mix | Amersham | 28-4065-51 | ||
| dt-T7 oligo | Custom | Midland Certified | ||
| Second strand buffer (5x) | Invitrogen | Y01129 | ||
| DTT | Supplied with second strand buffer | |||
| E.coli DNA Ligase | Invitrogen | 100002324 | ||
| DNA polymerase I | Invitrogen | 100004926 | ||
| Rnase H | Invitrogen | 18021-071 | ||
| Megascript T7 kit | Ambion | AM1334 | ||
| Random primers | BMB | 11034731001 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 56575 | in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT | |
| MEGAclear Kit | Ambion | 1908 | ||
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28206 | ||
| T4 DNA polymerase | Invitrogen | 100004994 | ||
| Rnasin | Promega | N251B | ||
| Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit | Ambion | AMIL1791 | ||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-87 | Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook | |
| Micromanipulator | Olympus | Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models | ||
| Pipette Holder | Warner Instruments | MP-S15A | Will vary with micromanipulator and pipette O.D. | |
| Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 |
Referenzen
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