Изучение нейронных основе адаптивной функции опорно-двигательного у насекомых

1. Прогулки поверхности Черная поверхность для ходьбы состоит из двух пластинок, покрытых никелем латунь постоянно присоединились бок о бок и электрически изолированы друг от друга на 2 мм широкая полоса 2-компонентный эпоксидный клей (UHU плюс, UHU GmbH, Германия) непосредственно под продольной оси животного. Они производят общей площадью 13.5×15.5cm (рис. 1). Разделение полуплоскостей для левой и правой ноги позволяет независимым предплюсны мониторинга контакта для одного нога с каждой стороны. Пластины смазывать глицерином / вода смесь в соотношении 95 частей глицерина до 5 частей насыщенного раствора NaCl передать скользкости и электропроводность; вязкость составляет примерно 430cStokes (Шанкар и Кумар, 1994). Смесь наносится непосредственно на поверхность и разгоняется с куском мягкой ткани для обеспечения общей толщиной 0.1-0.2мм. 2. Оптический установки Стимуляция Прогулки эпизоды вызывали с помощью двух проекторов, как описано в Scharstein (1989) к проекту полосатый рисунок на два раунда, экраны матового стекла (диаметром 130 мм, Марата экраны, Линос Photonics, Геттинген, Германия), которые расположены на расстоянии ок. 70 мм от глаз, и под углом 45 ° на левой и правой передней части пластины (рис. 1). Длина волны полосатый рисунок поддерживается на постоянном уровне при λ = 21 °. Отличие частоты перемещения стимулы могут варьироваться от 0,35, 0,72, 1,07 и 1.49Hz. Так как реакция животных зависит только от ω отличие частоты / λ (ω = угловой скорости, λ = шаблон длины волны), если картина контраст достаточно высок (Ферми и Reichhardt, 1963), у нас не меняются λ всей экспериментов . Яркость яркие полоски на стороне животного составляет около 15cd/m2 и контраст 0.8. Соединение глаз палкой насекомых (Carausius morosus) имеет 24 омматидиев в спинно-вентральной оси (Фриза, 1928) и еще несколько в rostro-каудальном оси. Как угол расхождения глаз насекомого палки в среднем на 6,2 ° (Jander и Волк-Henrichs, 1970) картина нашего длина волны была примерно в 4 раза угол омматидиев. Эксперименты создана в затемненные клетки Фарадея и выступал в затемненном помещении при температуре 20-22 ° С. Форвард ходьбе индуцирована прогрессивные картины на экраны, как полосы на каждом экране двигаться наружу, или один черный луч на белом фоне помещается между экранами Обращаясь индуцирована полосы движется в одном направлении на обоих экранах. Мы не нашли корреляции между скоростью перемещения полосы и угол поворота. Как только яркость полосатый рисунок установлен, чтобы побудить ходьбе, как правило, не требует дополнительной корректировки, но она может быть скорректирована с учетом различных животных в соответствии с потребностью на напряжение галогенных ламп в проекторах. 3. Подготовка экспериментальных животных Женский взрослых палочники (Carausius morosus) склеиваются (зубной цемент, ProTempII, 3M ESPE, Зеефельд, Германия) брюшной стороне вниз на тонкую палочку бальзы (3x5x100mm, ШхВхГ), которая вставляется в латунную трубку, которая имеет несколько разъемов. Животное удерживается в течение примерно минуты, пока клей по крайней мере частично затвердела. Голова и ноги торчат из передней и боковой части дюбель, чтобы их свободное передвижение. Области тазики всех ног, а также большая часть живота должен быть оставлен без клея. Насекомые голову, грудь и дистальных концах каждого бедра и голени, помечены флуоресцентными пигментами (д-р Кремер Farbmühle, Aichstetten, Германия), смешанный с зубным цементом для последующего отслеживания видео. 4. Размещение электродов ЭМГ Мышечная активность различных мышц ног, таких как, в данном примере, транспортир и мышцы втягивающим тазики, которые расположены в грудной клетке и причину затягивания (движение вперед) и ретракции (обратного движения) ноги, записывается с помощью электродов ЭМГ имплантируются в грудную клетку. Все ЭМГ записей дифференциально усиливается. Сигнал усиливался 100x в предусилитель (электроника мастерской, Зоологического института, Кельн), полосовой фильтр (100 Гц-2000 Гц), далее усиливается (10x), а импорт через АЦП в spike2 (Vers.5.05, КНИ, Кембридж, Великобритания). Электроды изготавливаются из покрытых медными проводами (Elektrisola, Eckernhagen, Германия; 47μm наружный диаметр). Для одного электрода, два провода сначала смазывают клеем, затем, два липкие провода скручены вокруг друг друга На одном конце скрученные концы проволоки припаиваются к мини-штекер. На другом конце провода обрезаются для обеспечения чистой заканчивается без изоляции для вставки в животное. EMG электроды Pluggeг в небольшой разъем на конце латунной трубки. Контактный Minuten используется для удара маленькие отверстия в кутикуле Вырезать концы электродов затем отделяется и вставляется в мышцах примерно на 1 мм расстоянии друг от друга, что, по нашему опыту, дает хорошее соотношение сигнал-шум. Следует проявлять осторожность, чтобы не вставить электроды слишком глубоко в мышцу, чтобы избежать его повреждения. На рисунке 2 показано расположение электродов в грудную клетку животного. На рисунке 3 показана животное с электродов провода на месте. Мы используем небольшую каплю клея histoacrylic (3M Vetbond, Павла, Миннесота, США) для хранения проводов на месте. Заземляющий провод вставляется в живот. 5. Запись предплюсны Контакт Предплюсны контакт всегда записывается вместе со следами EMG. С скользкую поверхность разделена на две половины, максимум два контралатеральной предплюсны контакты могут быть зарегистрированы в то же время. Для этой цели нога используется в качестве "переключателя", чтобы закрыть контур между пластиной и усилителя. Текущий могут быть применены к пластинам отдельно через два разъема на основании каждой пластины. Мы можем создать два квадратных волновых сигналов с 2-4 мВ амплитуды с генератора импульсов (модель MS501, электроника мастерской, Зоологического института, Кельн), которые фазе с задержкой на 90 °. Сигналы ослабляются 60 дБ (/ 1000) и применяется к две половинки скользкой поверхности. В этом эксперименте мы используем только один из двух сигналов. Она является одновременно подается в блокировку-в-усилителя опорного сигнала. 2-фазный синхронного усилителя (электроника мастерской, Зоологический институт РАН, г. Кельн) выборочно усиливает только сигнал той же частоты и фазы, как при условии ссылки сигнала. Второй канал только обнаруживает фазы 90 ° задержкой сигнала. Шум сигналы на частотах, отличных от опорной частоты, отвергаются и не влияют на измерение. Сигнал выхода усилителя подается на АЦП (Micro 1401k II, КНИ, Кембридж, Великобритания) и оцифрованных использованием Spike2. Между приземления и отрыва от лапки на и от скользкой поверхности, ток течет от пластины через лапки и голени в медной проволоки (см. ниже: 5.3-5.8). Выбран усилитель имеет высокое входное сопротивление (1 МОм) и напряжение сигнала очень мала для того, чтобы избежать влияния на ходьбе поведение животного. Ток, проходящий через лапки и голени составляет от 2 до 4nA. Время сигнала приводит во приземления, между вступлением в смазку и контактной поверхности составляет менее 1 мс. Переход контакт сигнала во время старта менее крутыми и более задерживается. Это связано с задержкой разрыв смазки от лапки на капиллярный эффект нарастания и за счет движения ног без полного отрыва в качели фазу. Латунной трубки с палкой бальзы которой животное клееного вставляется в микроманипулятора, чтобы по высоте животных в возрасте от 7 до 12 мм выше скользкой поверхности, что соответствует высоте в свободное ходьбе. Для измерения тока, когда насекомое лапки мониторинг ногу на землю, проволоки (диаметром 47μm) разрезается на примерно 15 см шт. Изоляции меди удаляются путем сжигания его подальше с алкоголем. Цикл образуется с одного конца провода и скользнул лапки животного Цикл связан с дистального конца большеберцовой кости, чтобы обеспечить хороший контакт между животным и проволоки. Проволока закрепляются на грудную клетку животного с каплей двухкомпонентного клея (ProTempII, см. выше), и подключены к дифференциальному усилителю через аллигатора зажимом. Для улучшения проводимости проволоки на концах, капля электрод наносится крем (Marquette Hellige, Фрайбург, Германия) в области контакта. Мощность сигнала затем проверяется на мониторе. В связи с низкочастотного фильтра свойства синхронного усилителя (10 мс постоянной времени) и постепенное lift-off/touch-down из Тарса, сигнал не точный квадрат сигнала. Один поэтому должен установить подходящие пороги близко к точке перехода, чтобы определить точные сроки предплюсны контакт и вручную проверить каждое событие определяется цифровизации программного обеспечения. На основании предплюсны контакт, мы определили время, когда лапка данного нога на земле, как позицию и момент, когда он был в воздухе, как качели фазу. Сигнал для камеры будет записываться одновременно с EMG след и предплюсны сигнальный контакт, и позволяет точно кадр за кадром корреляции поведения и записал следов. 6. Оптический Запись движения ног для цифровой анализ Степпинг частота палочники на скользкой поверхности может достигать 3-4 Гц (Graham и Круз, 1981). Перед записью ходьбе последовательности, зеркало находится на 45 ° за животное иметь дополнительный визуальный монитор для приземления. Камера внешне срабатывает и фотографии подаются в компьютер через FireWire интерфейс. Мы записываем ходьбе последовательности сверху камерой с высоким видео скорость (Marlin F-033C, Allied Видение технологий, Stadtroda, Германия) при 100fps для анализа движения ног в цифровом виде, и соотнести их с ЭМГ активности и предплюсны контакта. Во время записи ходьбе последовательности, животное освещается с голубой светодиодной массивы (30-50V DC, яркость 24cd, электроники семинар Зоологического института Кельнского университета), которые настраиваются по интенсивности освещения флуоресцентными маркерами. По данным литературы (Schlegtendal, 1934), палочники не обладают цветовым зрением и у нас не наблюдается неблагоприятного воздействия УФ-освещения свет на поворотный ответ. Желтый фильтр перед объективом камеры подавляет короткие волны активации светом и дает более высокую контрастность для видеозаписи. Видео файлы могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения отслеживания движения (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak службы, Берлин, Германия). 7. Запись Прогулки Последовательности В качестве контроля, во-первых минутах последовательности интактного животного фиксируется. Скорость полосатый рисунок установлен, и рисунок, и запись видео начинаются примерно в то же время. Если животное не запускается передвижения спонтанно, оно может быть стимулирован на животе с помощью кисти (Bassler и Вегенер, 1983), или дуновение воздуха на антеннах. В этом случае, животных коснулся левой части живота, как правило, повернуть налево и наоборот. Полосатый рисунок хранится движущихся пока животное не останавливается при ходьбе или только после 3 минут непрерывной записи. Для того чтобы проверить, как далеко мышечной активности в одной ноге, зависит от сенсорной информации из соседних ноги, животное вынужден autotomize ее ног. Сайт автотомии закрывается естественно за считанные секунды. Примером животное с autotomized передних и задних ног показано на рисунке 3. Например, для экспериментов с животными, имеющие только одного среднего ногу, мы вызывает деление на про-и заднегруди ноги, зажимая проксимального отдела бедренной кости с парой щипцов (Шмидт и Grund, 2003) или вырезать ноги на уровне тазиков После записи из интактного животного. После этого, как минимум, 30 минут для восстановления время уделяется животным. Затем мы записываем новый ходьбе последовательности, как раньше. В условиях ограниченной препаратов, нам часто приходится вызывать ходьбе использованием ударов кистью. 8. Представитель Результаты: Рисунок 1 Схема экспериментальной установки;. Фотографию палкой насекомых привязаны выше скользкой поверхности, помеченные флуоресцентными пигментами для ног слежения и проводной для EMG записи и предплюсны контактного измерения. B: электрической схеме двойного ноги лапок записи контакт во время ходьбы по скользкой поверхности. Рисунок 2. Позиции для размещения электродов ЭМГ в транспортир и втягивающего мышцы грудной клетки среднего ногу насекомого палку. М. Л.: средний ногу, FL: передняя нога . Рисунок 3 Придерживайтесь насекомых с проводами ЭМГ в про-и втягивающего мышцы средней ноги на месте, передние и задние ноги были удалены, чтобы изучить эффект присутствия соседних ног на кинематику и мышечной активности средних ног в снижение подготовки. Рисунок 4. Пример следов деятельности втягивающим ЭМГ с опорного сигнала лапок контакт в среднем в ногу во время поворота. В начале след (первая синяя коробка) втягивающее устройство является активным во время позиции, в то время как нога контакта с землей ("замкнутого контура"), указывая, что нога делает шаги вперед, а после короткого переключатель (вторая синяя коробка), втягивающее устройство является активным во время разгаре, в то время как нога в воздухе ("обрыв", третья синяя коробка), показывающий появление обратной направлены шаги. Рисунок 5. Снимок запись с транспортиром (верхний луч) и втягивающим устройством (в середине следа) мышцы и одновременно записываются лапок след контакта (внизу следов). Обратите внимание на переменном деятельности в следы ЭМГ что соответствует активности двух мышц в шаге цикла, то есть транспортир деятельность непосредственно перед и во времяразгаре, когда лапок след контакта сигналы потери контакта с землей, и втягивающим деятельности после и во время приземления на лапки, когда нога находится в позиции. Вставке показаны соответствующие видео-файл, соответствующий этой записи, которая используется для проверки поведения животного.