신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

1 부 : microfluidic 신경 장치를 준비 3 "석판술하여 SU – 8으로 만들어진 패턴으로 실리콘 웨이퍼는 Polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic 금형을 주조하는 데 사용됩니다. 우리는 마스터 금형, 또는 SU – 8 패턴 실리콘 웨이퍼를 참조"마스터 ". PDMS가 10시 1분의 오 / W 비율로 치료 요원과 함께 혼합되어 그 PDMS의 10g를 위해이다, 치료 요원의 1g 그것에 추가됩니다. PDMS 다음 잘 혼합하여 실리콘 웨이퍼 위에 부어 있습니다. 실리콘 웨이퍼는 10cm의 폴리스티렌 페트리 접시 안에 들어 있습니다. 그것은 약 4 mm의 두께로 마스터를 충당하기 위해 PDMS의 약 12​​g에 15g 걸립니다. PDMS와 함께 마스터는 다음 페트리 접시에서 뚜껑이있는 진공 dessicator에 배치하고, 진공이 적용됩니다. 이것은 치료 에이전트에 감동하는 동안 도입된 PDMS에서 공기 방울을 제거하는 데 도움 이루어집니다. 이것은 기포가 생겼는 지 약 15 분 제거하는 정도 소요됩니다. PDMS와 함께 마스터는 dessicator에서 제거됩니다. 0.45 음 필터와 공기총은 나머지 거품을 제거하는 데 사용됩니다. 마스터가 다음 치료 1 시간 80 ° C 뜨거운 접시에 배치됩니다. 참고 : 진공 dessicator를 사용할 수없는 경우, 마스터가 몇 시간 동안 실온에서 남아있을 수 있습니다. 공기 방울은 결국 자신에 분산됩니다. 뜨거운 접시를 사용할 수없는 경우, PDMS 24 시간 후 실온에서 치료됩니다. 참고 : 마스터가 치료 과정 수준에 있는지 확인하는 것도 중요하다. 2 부 : 뉴런 microfluidic 장치를 절단 PDMS가 마스터에서 치료되면, 그것은 깨끗한 후드로 이동합니다. 외과 블레이드를 사용하여 원형이 장치의 주위에 상처입니다. 때 하나 삽입 PDMS에 블레이드, 이것은 실리콘 웨이퍼와 접촉하도록하지만 웨이퍼에 너무 많은 부담을주지하는 것이 중요하다, 다른 마스터 균열 것입니다. 원형의 장치 (각 3 "실리콘 마스터 당 사 장치가있다) 주변의 모든 방법을 잘라와 PDMS는 신중하게 마스터를 해제합니다. 그것이 이전 절단에 삽입되는 등 이것은 부드럽게 외과 블레이드를 복잡하게 시작할 수 있습니다 . 다음 저수지는 8mm 조직 생검 펀치를 사용하여 장치에 펀치입니다. 장치는 다음 등분하고 초과 PDMS는 장치 코닝 유리 커버 (번호 1) 24mm X 40mm에 맞게 깔끔하게 수 있도록 거리에 손질하고 있습니다. 질소 공기 초과 파편을 날려하는 데 사용됩니다. 고집 파편 또한 3M 스카치 브랜드 471 비닐 테이프를 사용하여 제거할 수 있습니다. 파트 3 : 플라즈마는 유리 커버 풀렸는데에 장치를 결합. 플라즈마 클리너는 커버 전표에 Harrick은 신경 세포 장치 결합하는 데 사용됩니다. 간단히, 장치는 플라즈마 클리너에 배치하고 진공 펌프는 챔버에서 공기를 대피하는 데 사용됩니다. 진공 압력은 300 milliTorr에 도달하면, 전력은 전기 코일에 켜져 고로 설정되어 있습니다. – 전기 코일은 "전자, 이온 및 중성 원자 또는 분자로 구성된 부분적으로 이온화 가스"플라즈마를 생성 http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php 밖으로 남아있는 공기 분자의 챔버에 남아. 플라즈마는 유리와 영구 채권을 형성합니다 함께 배치하면 장치의 표면에 반응 종을 만듭니다. 플라즈마는 액체의 추가를 용이하게하는 데 도움이 친수성 ​​표면을 켭니다. 또한, 플라즈마 청소기 장치를 sterilizes. microfluidic 장치가 들어있는 PDMS 장치의 표면은 유리 슬라이드와 함께 플라즈마 클리너로 얼굴을 배치됩니다. 유리와 microfluidic 장치의 플라즈마 표면 처리 후 무균 60mm 요리에 배치, 깨끗한 벤치에서 서로 연락을 조립하고 있습니다. 처리 표면 꽉 돌이킬 유대를 형성하고 있습니다. 플라즈마는 유리에 장치를 결합 10 분 이내, 폴리 – L – 라이신 (PLL)가 장치에 추가됩니다. 십분 후, 장치의 친수성은 어렵게 PLL이 장치를 입력할 수 있도록하고 감소합니다. 참고 : PLL의 추가 후 장치에 기포를 확인하는 것이 중요합니다. 그들은 세포를 산화처럼 기본 채널에 공기 방울이 원하지 않는 수 있습니다. 기존의 기포를 제거하는 쉬운 방법은 액체의 150 UL (이 경우 PLL)를 가득 P200 pipet을 사용하는 것입니다, 메인 채널의 개통에 직접 팁을 장소, 강제 P200를 놓으면 되죠. 이것은 여러 번 반복해야 할 수도 있지만 pipet에서 결국 힘이 거품을 몰아 것입니다. PLL을 포함하는 장치는 37 표준 조직 문화 인큐베이터에서 하룻밤 부화 허용 ° C와 5 % CO 2. 다음날, 드나쁜가 autoclaved dH2O로 두 번 빠르게 씻어서 있습니다. 이 과정에서, 액체는 완전히에서만 저수지에서 메인 채널에서 제거되지 않습니다. 기본 채널에서 액체를 제거하면 거품을 소개합니다. 이 빠른 rinses 후, 장치는 autoclaved dH2O 가득한 3 시간 최소 인큐베이터에 다시 배치하거나,​​ 하룻밤 있습니다. 그 다음날, 장치가 다시 한 번 autoclaved dH2O 2 배 빨리 씻어서 있습니다. 그런 다음, 필요한 보조제 culturing 기본 쥐의 뉴런에 B27 및 glutamax를 포함하는 신경 기저 미디어, 장치에 추가됩니다. 장치는 나중에 사용하기 위해 인큐베이터에 다시 배치됩니다. 디바이스는 이제 뉴런의 시딩에 대한 준비가되어 있습니다.