Derivación de linfoma tímico líneas de células T de Atm - / -</sup Y P53 - / -</sup Ratones
Summary
En este video se demuestra un protocolo para establecer ratón timo líneas celulares de linfoma. Siguiendo este protocolo, hemos establecido con éxito varias líneas de células T de la ATM-/ – y p53-/ – ratones con linfoma del timo.
Abstract
Las líneas celulares establecidas son una herramienta de investigación fundamental que puede reducir el uso de animales de laboratorio en la investigación. Ciertas cepas de ratones genéticamente modificados, tales como ATM – / – y p53 – / – consistentemente desarrollar linfoma del timo primeros años de vida 1,2, y por lo tanto, puede servir como una fuente confiable para la derivación de murino líneas de células T. Aquí presentamos un protocolo detallado para el desarrollo de linfomas tímicos murinos establecido líneas de células T, sin necesidad de añadir las interleucinas como se describe en los protocolos anteriores 1,3. Los tumores se cosecharon de los ratones de tres a seis meses, en la primera indicación de tumores visibles sobre la base de la observación de la postura encorvada, dificultad para respirar, la preparación pobre y perder en un 1,4 cepa susceptible. Hemos establecido con éxito varias líneas de células T que utilizan este protocolo y cepas puras de ATM – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 y p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 ratones. Además, demuestran que más del 90% de lo establecido población de células T expresa CD3, CD4 y CD8. De acuerdo con las líneas celulares establecidas de forma estable, las células T generados por el uso del presente Protocolo se han pases para más de un año.
Protocol
Discussion
En este protocolo, se proporcionan procedimientos detallados para establecer murino líneas de células T a partir de dos genotipos diferentes del ratón, ATM – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] y p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Mediante el uso de este protocolo, un total de 6 (de 7 intentos) ATM – / – y tres (de 5 intentos) p53 – / – murino líneas de células T se han establecido en nuestro laborato…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Boris Reizis del Departamento de Microbiología e Inmunología en la Universidad de Columbia útil para los debates. También queremos agradecer a la Dra. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell y Mahamed Deequa del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Cornell para la asistencia técnica con la citometría de flujo y Lu Huang para obtener ayuda con la edición de vídeo. Los autores también desean agradecer a los miembros de Duhamel y los laboratorios de Weiss para su revisión crítica de la producción de manuscritos y de vídeo, y Yazinski Stephanie Weiss en el laboratorio de reproducción y genotipo p53 – / – ratones. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por Cornell Cuidado de Animales Institucional de la Universidad y el empleo. Esta investigación fue financiada en parte con fondos proporcionados por el Departamento de Agricultura de EE.UU., Estado de Investigación Cooperativa, Educación y Servicio de Extensión, Salud Animal y el Programa de Investigación de Enfermedades (para el GED y AMR) y las subvenciones del NIH R03 HD058220 y R01CA108773 (a RSW). El video fue producido utilizando en instalaciones de la casa por el personal de los laboratorios de Duhamel & Weiss.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
Referenzen
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- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
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