Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

<p class="jove_title"> 1. Изоляция Всего РНК из<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em> С помощью ферментативного лизиса</p><ol><li> Подготовка РНКазы работы без зону с помощью РНКазы ZAP (Амбион).</li><li> Подготовьте новую рабочую lyticase реагента, добавляя 1 мл РНКазы без воды непосредственно к lyticase флакон, чтобы сделать окончательный рабочий раствор 10 ед / ул. Vortex хорошо, и инвертировать в несколько раз, чтобы гарантировать полное перемешивание. Это 10 единиц / мкл раствора стабилен в течение 12 часов.</li><li> Подготовьте свежий ДНКазы я решения с использованием комплекта Qiagen ДНКазы и хранить на льду.</li><li> Label 1,7 мл микроцентрифужную пробирку с идентификационной информацией. Передача 1,5 мл соответствующей культуры дрожжей в трубу.</li><li> Центрифуга трубки при 5000 мкг (около 3 / 4 полной скорости) в течение 2 минут при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант (не нарушая гранул) с помощью микропипетки и отбросить супернатант.<strong>**** Повторите шаг 4, если размер гранул является слишком маленьким или если этого требует инструктор .****</strong</li><li> Добавить 1000 мкл DEPC воде гранулы, вихревые, и центрифуге при 5000 мкг в течение 2 минут. Удалите супернатант. Удалить столько жидкости, как можно дальше от дрожжей гранул.</li><li> Добавьте в дрожжи гранул и вихревые перемешать.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10 мкл</td></tr><tr><td> Lyticasesolution (10u/μl)</td><td> 30 мкл</td></tr></tbody></table</li><li> Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре.</li><li> Мягко вихревые трубки каждые 10 минут, чтобы генерировать сферопластов. Сферопластов нужно обращаться осторожно. Изучить дрожжей под микроскопом, чтобы наблюдать полное spheroplasting. При изучении дрожжей на предметное стекло, добавляют небольшое количество 0,1% SDS, чтобы заставить дрожжи набухают и образуют идеальной сферы (даже для начинающего клеток). Это означает, что клеточные стенки были переварены.</li><li> Добавить 350 мкл б-RLT буфер для трубки и вихревые<strong> Энергично</strong> В течение 1 минуты. Убедитесь, что ваша трубка плотно закрытой путем проведения закрытой крышкой в ​​то время как вортексе. Эта процедура будет лизировать сферопластов.</li><li> Добавить 250 мкл 100% этанола, трубки и кратко вихря. Осадка могут образоваться после добавления этанола, но это не повлияет на сбор РНК.</li><li<strong> Сбор РНК:</strong> Label RNeasy колонке спина с Вашей идентификации история, информация тщательно перенести все решения, начиная с шага 10 до спина столбца с помощью микропипетки. Будьте осторожны и не прикасайтесь кремнезема мембраны с пипеткой чаевые. Закройте трубы и центрифуги в течение 15 секунд на полной скорости. РНК в образце будет придерживаться кремнезема оболочки спин колонки.</li><li> Удалить спина столбец из коллекции трубки. Внесите проходят через жидкость (жидкость в пробирку) обратно на спину колонны и центрифуги снова. Отменить сбор трубку (с потока через жидкость) и место спином столбца в новый 2 трубки коллекция мл.</li><li> Добавить 350 мкл буфера для RW1 спин колонки. Это решение используется для мытья РНК и удаления солей и растворенных распада клеток. Закройте трубы и центрифуги в течение 15 секунд на полной скорости.</li><li<strong> Переваривания ДНК:</strong> Удалить спина столбец из центрифуг, откройте крышку трубки и добавить 80 мкл раствора ДНКазы я к середине мембраны колонке спина. Этот шаг будет переваривать любую gDNA в образце. Закрыть крышкой колонки и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.</li><li> Перевести спин колонки новый 2 трубки коллекция мл.</li><li<strong> Уборка и мытье РНК:</strong> Добавить 350 мкл буфера для RW1 спина колонны и центрифуги на полной скорости в течение 15 секунд.</li><li> Убрать пробирки и место спином столбца в новый 2 трубки коллекция мл.</li><li> Добавить 500 мкл буфера для НПП спин колонки для мытья РНК на кремний мембраны. Закройте трубы и центрифуги в течение 15 секунд на полной скорости<em>.</em</li><li> Убрать пробирки и место спином столбца в новый 2 трубки коллекция мл.</li><li> Мойте кремнезема мембраны снова, добавив еще 500 мкл буфера для НПП спин колонки. Закройте трубы и центрифуги в течение 15 секунд на полной скорости.</li><li> Место спина колонку в новой 2 мл трубки сбора и центрифуги в микроцентрифужных на полной скорости в течение 1 минуты для обеспечения наличия остатков жидкости удаляется из кремнезема мембраны.</li><li<strong> Восстановление РНК:</strong> Перевести RNeasy колонке спина к новым 1,7 мл микроцентрифужных трубки, который был помечен ваш образец информации. Обратите внимание, что шапка новые трубы будут оставаться открытыми в течение ближайших нескольких шагов.</li><li> Осторожно пипетки 30 мкл РНКазы без воды<strong> Непосредственно на центр</strong> Кремнезема мембраны.<strong> Не прикасайтесь кремнезема мембраны с наконечником пипетки (см. диаграмму)</strong>. Посмотрите внимательно, как вы выполните эту команду. Используйте обе руки, чтобы руководство пипетки. Убедитесь, что вода равномерно распределяется на мембране.</li><li> Инкубируйте спин колонки при комнатной температуре в течение 1 минуты. Центрифуга на полной скорости в течение 30 секунд.</li><li> Осторожно передачи 30 мкл, который подлежит возврату в 1,7 мл трубку обратно на центр кремнезема оболочки одном столбце спина, как в пункте 22 выше. Место колонке обратно в том же 1,7 мл трубки коллекции и инкубировать в течение 1 минуты при комнатной температуре. Центрифуга в течение 1 минуты на полной скорости. Эта двойная элюирования гарантирует, что максимальное количество РНК выделяют из мембраны.</li><li> Label два новых 1,7 мл микроцентрифужных труб с Вашей идентификации и передачи информации все восстановленные образцы РНК к одной из этих труб.</li><li> Передача 4 мкл этого образца для других меченых трубки. Этот пример будет транспортироваться обратно в УВМ для Nanodrop количественного и РНК качественной оценки (Это для проверки РНК количественного и качественного анализа, проведенного на сайте в участвующих в институт).</li><li> Поместите все образцы на льду.</li><li<strong> РНК Количественное:</strong> Использование Biophotometer Эппендорф, измерять поглощение пробы РНК на спектрофотометре при 1 до 50 разведения (1 мкл образца + H 49μl₂ О).</li><li> Оцените качество РНК с помощью E-гель (Invitrogen), 1,2% сборного агарозном геле для электрофореза.</li><li<strong> РНК Качественный анализ:</strong> Настройка E-гель-электрофореза аппаратом. Предварительно запустить геля в течение 2 минут в соответствии с процедурой производителя. После предварительной запустить, удалить гель расческу и добавить 14 мкл воды в каждую лунку затем 1 мкл каждого образца в каждую лунку. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Используйте соответствующие лестница ДНК размером в один хорошо для сравнения размеров позже (Биолайн Легкая Лестница я размер стандартного или Novagen ПЦР-маркер). Запись, образец которого в каждом переулке. Выполнить геля в течение 20 минут.</li><li> Сфотографируйте геля.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Первой цепи кДНК Синтез</p><ol><li> Label 0,5 мл ПЦР-трубки с идентификационной информацией. От концентрации РНК определяется из выше эксперименте, рассчитать объем образец до 3,0 мкг. Передача этой суммы к трубе. Добавьте достаточно РНКазы без воды, чтобы довести объем до 11,0 ул.</li><li> Добавить 1,0 мкл T7 олиго (дТ)₂₄ Реагента к трубе. Убедитесь в том, чтобы обратить особое внимание на объем кончиком пипетки на этом этапе, чтобы гарантировать, что все реагенты были переданы. Вихревые трубки и центрифуги на полной скорости в течение 5 секунд. Поместите пробирку в амплификаторе установлена ​​на уровне 70 ° С в течение 10 минут.</li><li> В то время как 70 ° С инкубационный в прогресс, подготовить первый Mix Master нить в новую трубу. Не забудьте добавить следующие реагенты<strong> Для того,</strong> Вихря и центрифуги на полной скорости в течение 5 секунд и положите трубку на льду.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Во-первых Mix Master нити:</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4 мкл</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2 мкл</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1 мкл</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1 мкл</td></tr></tbody></table<br> Использовать P2 микропипетки для измерения объемов 2 мкл и менее.</li><li> После 70 ° С инкубационный в шаге 2 завершено, добавьте 8 мкл первый Mix Master прядь сделали в шаге от 3 до трубки, инкубировать в амплификаторе на 42 ° С в течение 60 минут. При первой инкубации синтеза нить закончится, место трубки на льду. Во время этой инкубации подготовить второй Mix Master пряди.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Вторая цепь кДНК Синтез</p><ol><li> Сделайте следующее второй Mix Master нить в новую трубу. Держите его на лед. Vortex и центрифуги все реагенты перед использованием. Добавить реагенты в указанном порядке.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Во-вторых Mix Master прядь</strong</td></tr><tr><td> DEPC воды</td><td> 91 ул</td></tr><tr><td> 5 вторых буфера Strand</td><td> 30 ул</td></tr><tr><td> ДНТФ (10 мм)</td><td> 3 уль</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> ДНК-лигазы (10U/ul)</td><td> 1 мкл</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> ДНК-полимеразы I (10U/ul)</td><td> 4 уль</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> РНКазы H (2U/ul)</td><td> 1 мкл</td></tr></tbody></table</li><li> Вихревые трубки и центрифуги в течение 5 секунд на полной скорости.</li><li> При 42 ° С инкубационный закончена, перенести все 130 мкл второй Mix Master прядь на образец трубки, содержащей РНК и первые реагенты пряди. Vortex и центрифуги в течение 5 секунд при комнатной температуре. Инкубируйте пробирку в течение 2 часов при 16 ° С в амплификаторе.</li><li> В конце 2-часовой инкубации и в то время как образец все еще находится на 16 ° С, добавить 2μl Т4 реагента ДНК-полимеразы к трубе. Кратко вихря и центрифуги трубы и инкубировать при 16 ° С не более чем на 5 дополнительных минут. Инкубация больше, чем за 5 минут может привести к снижению качества кДНК из-за 3'to деятельности 5'exonuclease из полимеразой Т4.</li><li> В конце 5 минут инкубации, добавить 10 мкл 0,5 М ЭДТА, чтобы остановить реакцию T4 ДНК-полимеразы. Магазин трубки при температуре -20 ° C.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Осаждением кДНК</p><ol><li> Центрифуга Гель ФАПЧ трубки на полной скорости в течение одной минуты, чтобы застраховать гель в нижней части трубы.<strong> НЕ вихревые трубки ЗАМОК ФАЗА</strong>.</li><li> Добавить 162 мкл<strong> Нижний слой</strong> С рН 8,0-Tris буфере фенол / хлороформ / изоамиловый спирт (PCI) с содержимым второй цепи кДНК трубки реакции синтеза и вихрь в течение 5 секунд для перемешивания содержимого (общий объем кДНК шаг синтеза из выше эксперимент составляет 162, ул. шагом PCI требует равных объемов водной и органической смеси).</li><li> Перевести все кДНК-PCI смеси гелевой фазы блокировки трубки использованием микропипеткой.<strong> НЕ VORTEX</strong> Гелевой фазы блокировки трубки.</li><li> Центрифуги на полной скорости в течение 2 минут.</li><li> Label новый 1,7 мл микроцентрифужных трубки. Используйте микропипеткой для передачи верхним слоем из геля трубки Блокировка фазы вновь помечены 1,7 мл трубки. Постарайтесь собрать как можно больше слоев, насколько возможно.</li><li> Добавьте в 1,7 мл трубки микроцентрифужных и вихря.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> Этанол (100%)</td><td> 405 уль</td></tr><tr><td> NH₄ OAc</td><td> 80 ул</td></tr><tr><td> Пеллет Paint</td><td> 1 мкл</td></tr></tbody></table</li><li> Поместите трубку в центрифуге с шарниром трубки наружу и центрифуги на полной скорости в течение 20 минут при комнатной температуре.</li><li> Аккуратно снимите трубку из центрифуги стараясь не беспокоить кДНК гранул. Гранулы должны быть розовыми и примерно размером зерна соли и на стороне трубки под петли. Место на лед и сразу же перейти к следующему шагу.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Очистка кДНК пеллет</p><ol><li> Использование P1000 микропипеткой, тщательно удалить все супернатант из трубки. Будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок. Помните, что ваш шарик образца!</li><li> Добавить 500 мкл холодного 80% этанола (хранится в -20^° С морозильная камера) к трубе. Аккуратно колпачок трубки и инвертировать его медленно несколько раз. Следите за своими гранул очень внимательно. Если шарик отрывается, место трубку обратно в стойку и пусть гранулы оседают на дно. Кроме того, вы можете центрифуге трубки на полной скорости в течение 15 секунд, чтобы получить гранулы вниз к нижней части трубы.</li><li> Использование P1000 микропипеткой, осторожно удалите этанола быть очень осторожными, чтобы не мешать гранул. Совет трубку чтобы удаление столько жидкости, как это возможно.</li><li> Повторите шаги 2 и 3 с новым аликвоту 80% этанола.</li><li> Наконец, удалить все этанола можно, используя P1000 микропипеткой. Центрифуга трубки на полной скорости в течение 5 секунд и с помощью P20 микропипеткой, удалить последние несколько мкл этанола. Цель состоит в том, чтобы удалить как можно больше этанола в качестве возможного, не нарушая гранул.</li><li> Открытые трубки в стойке или в сушильном шкафу в течение 10-20 минут для испарения оставшейся этанола. Высушенный осадок легко теряются, когда он будет сухим. Becareful обрабатывать трубки мягко. Когда закончите, закройте крышкой. Визуализируйте сушеные гранулы для подтверждения она присутствует в трубке.</li><li> Ресуспендируют гранул в 22 мкл РНКазы без воды и поместить трубку на льду.</li></ol><p class="jove_title"> 6. InVitroTranscription (ИВТ)</p><ol><li> ENZO bioarray Комплект содержит все реагенты, необходимые для подготовки биотин помечены кРНК из кДНК.<br /> Mixfor мастер весь класс будет подготовлен в качестве follows.The инструктор подготовит эту смесь или назначить кого-то из класса. Это должно быть сделано в РНКазы зоны свободной.<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Amt / образец</td><td> # Образцы</td><td> Всего</td></tr><tr><td> Реагент 1 [10x Буфер Реакция]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Реагент 2 [10x Biotinnucleotides]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Реагент 3 [10x DTT]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Реагент 4 [10x ингибитора РНКазы]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Реагент 5 [20x Т7 РНК-полимеразы]</td><td> 2μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Общий объем</td><td> 18 мкл</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br><strong> Примечание:</strong> Подготовьте достаточное Mix Master для количества образцов плюс один. Это обеспечит достаточно для пипетирования целей.</li><li> Label 0,5 мл ПЦР трубки. Смешайте следующие в трубки и пипетки вверх и вниз несколько раз перемешать. Спина в центрифуге на полной скорости в течение 5 секунд, чтобы получить все реагенты на дно трубы.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> КДНК смеси</td><td> 22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td> 18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td> 40μl</td></tr></tbody></table</li><li> Инкубируйте пробирку при 37 ° С for16 часов в амплификаторе. Когда реакция завершена, хранения образцов при температуре -20 ° C</li></ol><p class="jove_title"> 7. Очистка Биотинилированные кРНК</p><ol><li> Передача всей выборке кРНК к новой трубки микроцентрифужных 1,7 мл. Добавить 60 мкл РНКазы без воды и 350 мкл буфера RLT и вихревые течение 5 секунд.</li><li> Добавить 250 мкл 100% этанола и вихрь снова.</li><li> Label RNeasy колонке спина и передачи всей выборке кРНК к колонке. Будьте осторожны и не прикасайтесь кончиком пипетки к кремнезема мембраны. Закрыть крышкой и центрифуги в течение 15 секунд на полной скорости.</li><li> Удалить спина столбец из коллекции трубки. Внесите проходят через жидкость (жидкость в пробирку) обратно на спину колонны и центрифуги снова в течение 15 секунд.</li><li> Место спина колонку в новой 2 мл трубки сбора и пипетки 500 мкл буфера ПЭС на спину колонке. Закройте трубы и центрифуги в течение 15 секунд на полной скорости. Отменить сбор и трубки проходят через жидкость. Место спина столбца в новый 2 трубки коллекция мл.</li><li> Добавить еще 500 мкл буфера для НПП спин колонки.</li><li> Перевести спина колонку в новой коллекции трубки и выполнять колонке "сушки" вращаются на полной скорости в течение 2 минут.</li><li> Label новый 1,7 мл микроцентрифужную пробирку с идентификационной информацией. Передача спин колонки к этой трубе.</li><li> Внесите 30 мкл РНКазы без воды на центр RNeasy мембраны кремнезема и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 минуты. Закройте трубы и центрифуги в течение 1 минуты на полной скорости.</li><li> Осторожно передачи 30 мкл, который подлежит возврату в 1,7 мл трубку обратно на центр RNeasy мембраны кремнезема же столбце спина. Место колонке обратно в тот же 1,7 мл трубки коллекции и инкубировать в течение 1 минуты при комнатной температуре. Центрифуга в течение 1 минуты на полной скорости. Эта двойная элюирования гарантирует, что максимальное количество кРНК извлекают из мембраны.</li><li> Перевести эту чистую меченных биотином кРНК к новым 1,7 мл трубки центрифуги и маркировать соответствующим образом.</li><li> Определить концентрацию кРНК используя ту же процедуру, как описано выше во время процедуры выделения РНК. Запись концентрация и соотношение 260/280.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Фрагментация кРНК для целевой подготовки</p><ol><li> Label 0,5 мл ПЦР-трубки с идентификационной информацией. Передача 5 мкг эквивалентное количество кРНК к трубе. Добавьте достаточно РНКазы без воды довести общий объем до 16,0 мкл, а затем добавьте 4,0 мкл 5X буфера фрагментации к трубе. Общий объем в трубе должна быть 20,0 ул.</li><li> Вихревые трубки и центрифуги в течение 10 секунд. Выдержите трубки при 94 ° С в течение 30 минут в амплификаторе. Положите на льду после инкубации.</li></ol><p class="jove_title"> 9. Оценка Фрагментированные и нефрагментированной кРНК использованием агарозном геле</p><ol><li> Настройка E-гель-электрофореза аппаратура с использованием 1,2% сборного агарозном геле. Предварительно запустить геля в течение 2 минут в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя</li><li> Добавить 14 мкл воды в каждую лунку по E-гель.</li><li> Добавить 2μl каждого образца в каждую лунку и пипетки вверх и вниз, хорошо перемешать. Анализ как фрагментированные и нефрагментированной кРНК каждого образца. Лучше всего для загрузки образцов (раздробленной и нефрагментированной) в соседних переулках. Запись личности каждого образца в каждом переулке.</li><li> Добавить 4 мкл ДНК лестницы (Биолайн Легкая Лестница я размер стандартного или Novagen ПЦР маркер) для одной полосы геля</li><li> Выполнить геля в течение 20 минут.</li><li> Визуализация E-гель на transilluminator. Возьмите гель картину.</li></ol><p class="jove_title"> 10. Гибридизация с Дрожжи 2,0 GeneChip</p><p class="jove_step"> Результаты представитель:</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Рисунок 1.</strong> Отсканированных Дрожжи Affymetrix GeneChip изображения (Affymetrix GeneChip Операционная Software (ГСНК))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figure2.</strong> 2D участок разброс всех генетических стенограммы (~ 6700 генов), по сравнению контроля и лечения данных дрожжей. Каждая точка представляет одного гена. Гены окрашены в фиолетовый указывают генов, которые разному экспрессируются гены в то время как окрашены в красный нет. Описания разному экспрессируются гены обозначены в соответствующей легендой и большинство из них вовлечены в клеточный цикл управления в этом примере. (Affymetrix GeneChip Операционная Software (ГСНК))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" ><strong> Рисунок 3.</strong> Эта блок-схема иллюстрирует разному экспрессируются гены в пострадавших биологическим путем. Гены обозначаются красной звезды указывают вниз-регулируемых генов в мейотических пути. (База данных для аннотаций, визуализации и интегрированной Discovery (Давид)</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" ><strong> Рисунок 4.</strong> Представитель Результаты Вулкан участок. Контроль и обработанные образцы были сопоставлены с р-значение отрезаны от 0,05 и 1,5 раза выражения изменений отрезаны. Этот участок был создан с помощью программного обеспечения Genesifter Geospiza это любезно пожертвовал студентов в образовательных целях.</p>