Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

<p class="jove_title"> 1. Isolamento RNA totale da<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Utilizzando Lysis enzimatica</p><ol><li> Preparare un RNasi-free area di lavoro utilizzando RNasi ZAP (Ambion).</li><li> Preparare fresca reagente liticasi di lavoro con l'aggiunta di 1 ml di acqua RNase-free direttamente al flacone liticasi per ottenere una soluzione di lavoro finale di 10 U / ul. Vortex bene e capovolgere più volte per assicurare la completa miscelazione. Questo 10 unità / ul di soluzione è stabile per 12 ore.</li><li> Preparare fresca DNasi soluzione che ho utilizzando il kit Qiagen DNasi e memorizzare sul ghiaccio.</li><li> Etichettare una provetta 1,7 ml con le vostre informazioni di identificazione. Trasferire 1,5 ml della coltura di lievito appropriato nel tubo.</li><li> Centrifugare la provetta a 5000 g (circa 3 / 4 pieno regime) per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il sopranatante (senza disturbare pellet) utilizzando una micropipetta e scartare il surnatante.<strong>**** Ripetere il punto 4 se la dimensione pellet è troppo piccolo o se indicato dal docente .****</strong</li><li> Aggiungi 1000 microlitri di acqua DEPC al pellet, vortex e centrifugare a 5000 xg per 2 minuti. Scartare il surnatante. Rimuovere la maggior quantità di liquido possibile dal pellet lievito.</li><li> Aggiungere quanto segue il lievito pellet e vortex per miscelare.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10 microlitri</td></tr><tr><td> Lyticasesolution (10u/μl)</td><td> 30 microlitri</td></tr></tbody></table</li><li> Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li><li> Far ruotare delicatamente il tubo ogni 10 minuti per generare sferoplasti. Sferoplasti devono essere trattati con delicatezza. Esaminare il lievito al microscopio per osservare spheroplasting completo. Nell'esaminare il lievito sul vetrino, aggiungere una piccola quantità del 0,1% SDS a causare il lievito a gonfiarsi e formare sfere perfette (anche per le cellule in erba). Ciò indica che le pareti cellulari sono stati digeriti.</li><li> Aggiungere 350 microlitri b-RLT tampone nella provetta e miscelare<strong> Vigorosamente</strong> Per 1 minuto. Verificare che il tubo sia ben chiusa tenendo il coperchio chiuso, mentre vortex. Questa procedura lisare il sferoplasti.</li><li> Aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100% per il tubo e agitare brevemente. Un precipitato può formare dopo l'aggiunta di etanolo, ma ciò non pregiudica la raccolta di RNA.</li><li<strong> Raccolta l'RNA:</strongEtichetta> una colonna di spin RNeasy con la vostra identificazione informationand attentamente trasferire tutta la soluzione dal punto 10 alla colonna di girare utilizzando una micropipetta. Fare attenzione a non toccare la membrana di silice con la punta della pipetta. Chiudere il tubo e centrifugare per 15 secondi a piena velocità. L'RNA del campione aderirà alla membrana di silice della colonna.</li><li> Rimuovere la colonna rotazione dal tubo di raccolta. Pipettare il passaggio liquido (il liquido nel tubo di raccolta) di nuovo sul Spin Column e centrifugare di nuovo. Eliminare il tubo di raccolta (con il flusso attraverso fluido) e posizionare la colonna girare in un nuovo 2 ml di tubo di raccolta.</li><li> Aggiungere 350 microlitri di buffer RW1 alla colonna di spin. Questa soluzione viene utilizzata per lavare l'RNA e rimuovere i sali disciolti e detriti cellulari. Chiudere il tubo e centrifugare per 15 secondi a piena velocità.</li><li<strong> Digerire il DNA:</strong> Rimuovere la colonna rotazione dalla centrifuga, aprire il coperchio del tubo e aggiungere 80 ml di soluzione di DNasi I al centro della membrana colonna. Questo passo digerire qualsiasi gDNA nel campione. Chiudere il coperchio della colonna e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.</li><li> Trasferire la colonna di selezione per un nuovo tubo di raccolta 2 ml.</li><li<strong> Pulizia e lavaggio del RNA:</strong> Aggiungere 350 microlitri di buffer RW1 alla colonna e centrifugare girare a pieno regime per 15 secondi.</li><li> Eliminare il tubo di raccolta e posto la colonna di spin in un nuovo 2 ml di tubo di raccolta.</li><li> Aggiungere 500 microlitri di buffer RPE alla colonna di selezione per lavare l'RNA sulla membrana di silice. Chiudere il tubo e centrifugare per 15 secondi alla massima velocità<em>.</em</li><li> Eliminare il tubo di raccolta e posto la colonna di spin in un nuovo 2 ml di tubo di raccolta.</li><li> Lavare la membrana di silice di nuovo con l'aggiunta di altri 500 microlitri di buffer RPE alla colonna di spin. Chiudere il tubo e centrifugare per 15 secondi a piena velocità.</li><li> Posizionare la colonna di girare in un nuovo 2 ml di tubo di raccolta e centrifugare in una microcentrifuga a tutta velocità per 1 minuto per assicurare ogni residuo di liquido viene rimosso dalla membrana di silice.</li><li<strong> Ripristino del RNA:</strong> Trasferire la colonna RNeasy di selezione per un nuovo tubo di 1,7 ml microcentrifuga che è stata marcata con i tuoi dati di esempio. Si noti che il tappo del nuovo tubo rimarrà aperta per i passi successivi.</li><li> Attenzione pipetta 30 microlitri di acqua RNase-free<strong> Direttamente sul centro</strong> Della membrana di silice.<strong> Non toccare la membrana di silice con la punta della pipetta (vedi schema)</strong>. Guardare da vicino come si esegue questo passaggio. Con entrambe le mani per guidare la pipetta. Assicurarsi che l'acqua è distribuita uniformemente sulla membrana.</li><li> Incubare la colonna di spin a temperatura ambiente per 1 minuto. Centrifugare a massima velocità per 30 secondi.</li><li> Attenzione trasferire il 30 microlitri che viene recuperata nel tubo 1,7 ml di nuovo sul centro della membrana di silice della colonna rotazione stessa al punto 22 della presente sentenza. Montare la colonna di ritorno nello stesso tubo 1,7 ml di raccolta e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugare per 1 minuto alla massima velocità. Questo eluizione doppio assicura che la quantità massima di RNA viene recuperato dalla membrana.</li><lietichetta> due nuovi tubi microcentrifuga 1,7 ml, con le vostre informazioni di identificazione e il trasferimento di tutti i campioni di RNA recuperato a uno di questi tubi.</li><li> Trasferire 4 ml di questo campione per l'altro tubo etichettati. Questo esempio sarà trasportato indietro UVM NanoDrop per la quantificazione e valutazione qualitativa di RNA (questo è per convalidare l'analisi di RNA quantitativa e qualitativa effettuata in loco presso gli istituto).</li><li> Mettere tutti i campioni sul ghiaccio.</li><li<strong> RNA quantificazione:</strong> Utilizzo del BioPhotometer Eppendorf, misurare l'assorbanza del campione di RNA sullo spettrofotometro a una diluizione 1 su 50 (1ml campione + 49μl H₂ O).</li><li> Valutare la qualità dell'RNA utilizzando l'E-Gel (Invitrogen) 1,2% prefabbricati in gel di agarosio per l'elettroforesi.</li><li<strong> RNA Analisi qualitativa:</strong> Impostare la E-gel elettroforesi apparato. Pre-eseguire il gel per 2 minuti in base alla procedura del produttore. Dopo la pre-corsa, rimuovere il pettine gel e aggiungere 14 ml di acqua per ogni pozzetto seguito da 1ml di ciascun campione in ciascun pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù. Utilizzare un appropriato DNA Ladder dimensioni in un unico bene per il confronto dimensioni più tardi (Bioline Ladder Facile ho formato standard o Novagen PCR marker). Record che è campione in ogni corsia. Esegui il gel per 20 minuti.</li><li> Scattare una foto del gel.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Strand prima sintesi del DNA</p><ol><li> Etichettare una provetta da 0,5 ml PCR con le vostre informazioni di identificazione. Dalla concentrazione di RNA determinato dall'esperimento, calcolare il volume del campione per ottenere 3,0 ug. Trasferire tale somma al tubo. Aggiungere abbastanza acqua RNasi-free per portare il volume a 11,0 ul.</li><li> Aggiungere 1,0 microlitri T7 oligo (dT)₂₄ Reagente al tubo. Assicurati di prestare particolare attenzione al volume punta della pipetta durante questa fase per garantire che tutti i reagenti è stato trasferito. Vortex il tubo e centrifugare a massima velocità per 5 secondi. Posizionare il tubo in un termociclatore a 70 ° C per 10 minuti.</li><li> Mentre i 70 ° C di incubazione è in corso, preparare il primo master mix filo in un tubo nuovo. Assicurarsi di aggiungere i seguenti reagenti<strong> IN ORDINE,</strong> Vortex e centrifugare alla massima velocità per 5 secondi e posizionare il tubo in ghiaccio.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Primo aspetto master mix:</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4 microlitri</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2 microlitri</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1 ml</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1 ml</td></tr></tbody></table<br> Usa una micropipetta P2 per misurare i volumi di 2 microlitri o meno.</li><li> Dopo l'incubazione a 70 ° C al punto 2 è completo, aggiungere 8 ml di mix primo maestro filone made in fase 3 per il tubo ed incubare in un termociclatore a 42 ° C per 60 minuti. La prima volta di incubazione sintesi filamento è finito, posto il tubo sul ghiaccio. Durante questa incubazione, preparare il secondo master mix filamento.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Strand Synthesis secondo cDNA</p><ol><li> Crea il seguente secondo master mix filo in un tubo nuovo. Tenerlo in ghiaccio. Vortex e centrifugare tutti i reagenti prima dell'uso. Aggiungere i reagenti nell'ordine elencato.<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong> Secondo aspetto master mix</strong</td></tr><tr><td> DEPC Acqua</td><td> 91 ul</td></tr><tr><td> Buffer 5X Strand Seconda</td><td> 30 ul</td></tr><tr><td> DNTP (10mm)</td><td> 3 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA ligasi (10U/ul)</td><td> 1 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNA polimerasi I (10U/ul)</td><td> 4 ul</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> RNasi H (2U/ul)</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Vortex il tubo e centrifugare per 5 secondi a piena velocità.</li><li> Quando l'° 42 C di incubazione è terminato, il trasferimento di tutti i 130 microlitri della miscela secondo filone principale alla provetta contenente l'RNA e reagenti prima parte. Vortex e centrifugare per 5 secondi a temperatura ambiente. Incubare la provetta per 2 ore a 16 ° C in un termociclatore.</li><li> Al termine della incubazione 2 ore e mentre il campione è ancora a 16 ° C, aggiungere 2μl reagente T4 DNA polimerasi al tubo. Mescolare brevemente nel vortex e centrifugare la provetta ed incubare a 16 ° C per non più di 5 minuti supplementari. L'incubazione più lungo di 5 minuti possono ridurre la qualità del cDNA dovuta all'attività 5'exonuclease 3'to della polimerasi T4.</li><li> Alla fine della 5 minuti di incubazione, aggiungere 10 microlitri 0,5 M EDTA per fermare la reazione T4 DNA polimerasi. Conservare il tubo a -20 ° C.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Precipitare la cDNA</p><ol><li> Centrifugare una serratura tubo di fase gel a tutta velocità per un minuto per assicurarsi il gel è al fondo della provetta.<strong> NON VORTEX TUBI BLOCCO FASE</strong>.</li><li> Aggiungere 162 microlitri della<strong> Strato inferiore</strong> Dal pH 8.0-Tris tamponata fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (PCI) per il contenuto del secondo tubo di sintesi del DNA reazione filo e vortex per 5 secondi per mescolare il contenuto (il volume totale della fase di sintesi di cDNA dall'esperimento sopra è di 162 ul. Il passo PCI richiede volumi uguali di miscele acquose e organiche).</li><li> Trasferisci tutti i cDNA-PCI miscela al tubo di gel fase di bloccare con una micropipetta.<strong> NON VORTEX</strong> Il blocco del tubo fase gel.</li><licentrifugare> a piena velocità per 2 minuti.</li><li> Etichetta di una nuova provetta 1,7 ml. Utilizzare una micropipetta per trasferire lo strato superiore del tubo di gel fase di blocco per la nuova etichetta del tubo 1,7 ml. Prova a raccogliere il maggior numero dello strato il più possibile.</li><li> Aggiungere quanto segue il tubo 1,7 ml microcentrifuga e vortice.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> Etanolo (100%)</td><td> 405 ul</td></tr><tr><td> NH₄ OAc</td><td> 80 ul</td></tr><tr><td> Pellet Vernice</td><td> 1 ul</td></tr></tbody></table</li><li> Porre il tubo in centrifuga con la cerniera del tubo rivolto verso l'esterno e centrifugare alla massima velocità per 20 minuti a temperatura ambiente.</li><li> Rimuovere delicatamente il tubo dalla centrifuga stando attenti a non disturbare il cDNA pellet. Il pellet deve essere rosa e circa le dimensioni di un chicco di sale e sul lato del tubo sotto la cerniera. Luogo il ghiaccio e subito passare alla fase successiva.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Pulizia del cDNA Pellet</p><ol><li> Usando una micropipetta P1000, rimuovere con cura tutti i surnatante dal tubo. Fare attenzione a non disturbare il pellet. Ricordate che il pellet è il vostro campione!</li><li> Aggiungere 500μl di etanolo 80% freddo (-20 memorizzati in^° Congelatore C) al tubo. Delicatamente il tubo tappo e capovolgere lentamente più volte. Guarda i tuoi pellet molto da vicino. Se la pallina si stacca, posizionare il tubo indietro nel rack e lasciare che il pellet depositano sul fondo. In alternativa, è possibile centrifugare la provetta a pieno regime per 15 secondi per ottenere il pellet di nuovo verso il fondo della provetta.</li><li> Usando una micropipetta P1000, rimuovere con attenzione l'etanolo essere molto attenti a non disturbare il pellet. Punta il tubo per consentire la rimozione di quanto più liquido possibile.</li><li> Ripetere i punti 2 e 3 con una nuova aliquota del 80% di etanolo.</li><li> Infine, rimuovere tutte le etanolo possibile grazie ad un micropipetta P1000. Centrifugare la provetta a piena velocità per 5 secondi e con una P20 micropipetta, rimuovere l'ultima pochi microlitri di etanolo. L'obiettivo è quello di rimuovere l'etanolo più possibile senza disturbare il pellet.</li><li> Posizionare il tubo aperto in un rack o box di asciugatura per 10-20 minuti per far evaporare l'etanolo residuo. La secca pellet è facilmente perso una volta che è asciutto. Attenti a gestire il tubo dolcemente. Al termine, chiudere il tappo. Visualizza la secca pellet per confermare che è presente nel tubo.</li><li> Risospendere il pellet in 22 ml di acqua RNase-free e posizionare il tubo in ghiaccio.</li></ol><p class="jove_title"> 6. InVitroTranscription (IVT)</p><ol><li> Il ENZO bioarray kit contiene tutti i reagenti necessari per preparare biotina cRNA etichettati da cDNA.<br /> Un mixfor padroneggiare l'intera classe verrà preparato come istruttore follows.The preparerà questo mix o designare qualcuno dalla classe. Questo deve essere fatto in un RNasi-free.<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Amt / campione</td><td> # Campioni</td><td> Totale</td></tr><tr><td> Reagente 1 [tampone di reazione 10x]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagente 2 [Biotinnucleotides 10x]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagente 3 [DTT 10x]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagente 4 [inibitore RNAsi 10x]</td><td> 4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagente 5 [20x T7 RNA polimerasi]</td><td> 2μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volume totale</td><td> 18 microlitri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br><strong> NOTA:</strong> Preparare mix sufficiente master per il numero di campioni più uno. Ciò contribuirà a garantire a sufficienza per scopi pipettaggio.</li><li> Etichettare una provetta da 0,5 ml PCR. Combina le seguenti nel tubo e pipettare su e giù parecchie volte per mescolare. Spin in una centrifuga a piena velocità per 5 secondi per avere tutti i reagenti al fondo della provetta.<br /><table border="1"><tbody><tr><td> Miscela di cDNA</td><td> 22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td> 18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td> 40μl</td></tr></tbody></table</li><li> Incubare la provetta a 37 ° C for16 ore nel termociclatore. Quando la reazione è completa, conservare il campione a -20 ° C</li></ol><p class="jove_title"> 7. Pulizia del biotinilato cRNA</p><ol><li> Trasferire l'intero campione cRNA a un nuovo tubo di 1,7 ml microcentrifuga. Aggiungere 60 ml di acqua RNase-free e 350 microlitri di buffer RLT e vortex per 5 secondi.</li><li> Aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100% e di nuovo vortice.</li><li> Etichetta una colonna RNeasy spin e trasferire l'intero campione cRNA alla colonna. Fare attenzione a non toccare la punta della pipetta alla membrana di silice. Chiudere il coperchio e centrifugare per 15 secondi a piena velocità.</li><li> Rimuovere la colonna rotazione dal tubo di raccolta. Pipettare il passaggio liquido (il liquido nel tubo di raccolta) di nuovo sul Spin Column e centrifugare ancora per 15 secondi.</li><li> Porre la colonna girare in un nuovo 2 ml di tubo di raccolta e pipetta 500 microlitri di tampone RPE sulla colonna. Chiudere il tubo e centrifugare per 15 secondi a piena velocità. Eliminare tubo di raccolta e il passaggio del liquido. Porre la colonna girare in un nuovo 2 ml di tubo di raccolta.</li><li> Aggiungi altri 500 microlitri di buffer RPE alla colonna di spin.</li><li> Trasferire la colonna di spin in un tubo nuova collezione e di eseguire una colonna spin "asciugatura" a tutta velocità per 2 minuti.</li><li> Etichetta di una nuova provetta 1,7 ml con le vostre informazioni di identificazione. Trasferire la colonna di selezione per questo tubo.</li><li> Pipettare 30 microlitri RNase-free acqua sulla membrana RNeasy silice centro e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. Tappare la provetta e centrifugare per 1 minuto alla massima velocità.</li><li> Attenzione trasferire il 30 microlitri che viene recuperata nel tubo 1,7 ml di nuovo sul centro della membrana di silice RNeasy della colonna rotazione stessa. Posizionare la colonna indietro allo stesso tubo di 1,7 ml di raccolta e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugare per 1 minuto alla massima velocità. Questo eluizione doppio assicura che la quantità massima di cRNA viene recuperato dalla membrana.</li><li> Trasferire questa pulito biotina marcata cRNA a un nuovo tubo di 1,7 ml per centrifuga e l'etichetta in modo appropriato.</li><li> Determinare la concentrazione cRNA utilizzando la stessa procedura di cui sopra durante la procedura di isolamento del RNA. Si registra la concentrazione e il rapporto 260/280.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Frammentare il cRNA per la preparazione dei target</p><ol><li> Etichettare una provetta da 0,5 ml PCR con le vostre informazioni di identificazione. Trasferire 5 ug di una quantità equivalente di cRNA al tubo. Aggiungere abbastanza acqua RNasi-free per portare il volume totale a 16,0 ul, e quindi aggiungere 4,0 ml di tampone 5X frammentazione al tubo. Il volume totale del tubo deve essere 20,0 ul.</li><li> Vortex il tubo e centrifugare per 10 secondi. Incubare la provetta a 94 ° C per 30 minuti in un termociclatore. Mettere in ghiaccio dopo l'incubazione.</li></ol><p class="jove_title"> 9. Valutare il cRNA frammentati e non frammentati con gel</p><ol><li> Impostare la E-gel elettroforesi apparato utilizzando un prefabbricato 1,2% gel di agarosio. Pre-eseguire il gel per 2 minuti in base alle raccomandazioni per la fabbricazione di</li><li> Aggiungi 14 ml di acqua per ogni bene sulla E-gel.</li><li> Aggiungi 2μl di ciascun campione in ogni pozzetto e pipettare su e giù per mescolare bene. Analizzare sia il cRNA frammentato e non frammentato di ogni campione. E 'meglio per caricare i campioni (frammentata e non frammentati) in corsie vicine. Registrazione dell'identità di ciascun campione in ogni corsia.</li><li> Aggiungere 4 ml di una scala del DNA (Ladder Bioline Facile ho formato standard o Novagen PCR marker) a una corsia del gel</li><li> Esegui il gel per 20 minuti.</li><li> Visualizza la E-gel su un transilluminatore. Scattare una foto gel.</li></ol><p class="jove_title"> 10. Ibridazione al lievito GeneChip 2,0</p><p class="jove_step"> Rappresentante dei risultati:</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figura 1.</strong> Una scansione Affymetrix GeneChip lievito immagine (Affymetrix GeneChip software operativo (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figura 2.</strong> Scatter plot 2D di tutte le trascrizioni genetiche (~ 6.700 geni), confrontando un controllo e di dati trattati lievito. Ogni punto rappresenta un singolo gene. I geni colorata in viola indicano geni che sono espressi in modo differenziale, mentre i geni colorati in rosso non lo sono. Descrizioni per i geni differenzialmente espressi sono etichettati nella leggenda corrispondente e la maggior parte sono coinvolti nel controllo del ciclo cellulare in questo esempio. (Affymetrix GeneChip operativo Software (GCOS))</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" ><strong> Figura 3.</strong> Questo diagramma di flusso illustra in modo differenziato i geni espressi in un percorso di affetti biologico. I geni indicati con una stella rossa indicano il down-regolato geni del pathway meiotica. (Il database per l'annotazione, visualizzazione e Integrated Discovery (DAVID)</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" ><strong> Figura 4.</strong> Risultati rappresentante di un grafico a Vulcano. Campioni di controllo e trattati sono stati confrontati con un p-value tagliato di 0,05 e un cambiamento di espressione 1,5 volte tagliato fuori. Questo grafico è stata generata utilizzando il software Genesifter Geospiza è gentilmente donato agli studenti per scopi didattici.</p>