FRAP har använts för att kvantifiera rörlighet grön fluorescens protein (GFP)-märkta proteiner i odlade celler. Vi undersökte den mobila / orörliga fraktioner av GFP genom att analysera fluorescens återhämtning procent efter fotoblekning. I denna studie var FRAP utförs på ryggar av hippocampus neuroner.
FRAP har använts för att kvantifiera rörlighet för GFP-märkta proteiner. Med hjälp av en stark excitation laser, fluorescens en GFP-märkta proteinet blekt i regionen av intresse. Fluorescensen i regionen återhämtar sig när oblekt GFP-märkta proteinet från utanför regionen diffunderar in i regionen av intresse. Rörligheten av proteinet analyseras sedan genom att mäta fluorescens återvinningsgrad. Denna teknik kan användas för att karaktärisera proteiner rörlighet och omsättningshastighet.
I denna studie uttrycker vi (Enhanced grönt fluorescerande protein) EGFP vektor i odlade hippocampus nervceller. Använda Zeiss 710 konfokalmikroskop, photobleach vi fluorescenssignalen av GFP protein i en enda ryggrad, och sedan ta bilder tid förflutit att spela in fluorescens återhämtning efter fotoblekning. Slutligen räknar vi andelen mobila och orörliga fraktioner av GFP i taggar, genom att analysera bilddata med hjälp av ImageJ och Graphpad mjukvaror.
Detta FRAP protokoll visar hur du utför en grundläggande FRAP experiment samt hur att analysera data.
FRAP analys har i huvudsak använts i vivo och in vitro 1-2 studier. Denna teknik utnyttjar ofta GFP fusionsproteiner , även om det kunde också använda rödalgen fusionsproteiner 3. Denna analys är känslig och kan användas för att karaktärisera rörlighet för GFP-märkta proteiner.
Att skapa meningsfull FRAP analys är det viktigt att undvika onödiga fotoblekning före och under FRAP experimentet. Det finns två sätt att uppnå detta. Först bör processen att söka och följa den experimentella neuron vara snabb. Speciellt blekmedel observation av nervceller med ett 100X mål under en lång tid betydligt fluorescensen. För det andra, hög lasereffekt och täta scanning ökar ofta möjligheten till fotoblekning. Därför blir det nödvändigt att beräkna fotoblekning ränta i en kontroll region och sedan normalisera FRAP kurvan i den experimentella regionen. Den normalisering Metoden har beskrivits i protokollet (se steg 3,3-3,5 för detaljer).
Det fotoblekning steg är också avgörande för att säkerställa en god FRAP resultat. I detta experiment, blekmedel vi ryggraden av intresse 10 gånger på 100% laser överföring. Detta villkor är tillräckligt för att bleka fluorescens en ryggrad till bakgrundsnivån i ett fast beredning. Därför sätter vi fluorescensintensiteten till samma nummer som bakgrund på 0 sekunder efter fotoblekning. Beroende på hastigheten på första sökningen, kan en betydande del av fluorescens återhämtning redan kan upptäckas när proteinet av intresse är mycket rörliga.
Många fluorescerande proteinet prober har utvecklats för att studera proteiner dynamik med FRAP. Ett kompletterande tillvägagångssätt är till exempel att använda photoactivatable GFP (PA-GFP), eller photoconvertible varianter. Tillsammans med FRAP teknik, är dessa verktyg bli oumbärlig för live studier cell imaging 4-6.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institute on Dövhet och andra sjukdomar kommunikation (NIDCD) Interna Program.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35GC-1.0-14-C | ||
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech | 631312 | ||
pEGFP-N1 plasmid | Clontech | 6085-1 | ||
Zeiss confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | ||
Zeiss TempModule system | Zeiss | N.A. | ||
ImageJ software | NIH | N.A. | ||
Graphpad Prism software | Graphpad software | N.A. |