原位Xenografting人类荧光素酶标记的恶性外周神经鞘瘤细胞在体内测试候选治疗药物

1。非裸体的免疫缺陷小鼠（裸体株不必）的前期准备工作： 所有的程序事先审查和批准由UAB的机构动物护理和使用委员会和适当训练的人员进行。我们已经成功地使用了这些实验的免疫缺陷小鼠株：A）Foxchase远交SCID小鼠（CB17/lcr- Prkdc SCID / lcrCrl小鼠）; B）美国国立卫生研究院第三小鼠（NIHS催化剂BG Foxn1 怒江 BRK XID小鼠）和C ）的NOD -SCIDγ小鼠（NOD.Cg Prkdc SCID IL2RG tm1Wjl / SZJ小鼠）。在我们的手中，原位移植瘤的生长，在美国国立卫生研究院第三和NODSCIDγ小鼠，进行这两种基因突变影响T细胞，B细胞和NK细胞的功能几乎是相同的，此协议，移植所需的天数增长，在治疗开始和时代嫁接后进行成像时的时间是指那些有经验，我们用的NODSCIDγ小鼠。 Foxchase接枝增长远交SCID小鼠，在T -和B -细胞功能缺陷，通常需要较长的时间。 为了便于嫁接大量的非裸体的免疫缺陷小鼠，我们对下午的头发嫁接前从手术部位。小鼠麻醉用异氟醚诱导室，清除废气喷雾器。为了保持体温，动物在整个过程中的加热垫处理。快船队是用来去除头发从中期回落到膝盖就在身边，这是嫁接的后腿。任何剩余的头发，小心取出〜5分钟使用化学脱毛剂（如奈尔，尤其是敏感肌肤的芦荟产品）的网站。建议去除脱毛产品，因为它可以导致刺激皮肤，眼睛，以及它可能蔓延到其他身体表面。我们不移植坐骨神经在这两个实验，因为这可能会双边hindleg功能损害，造成损失的研究组在小鼠。 小鼠可以完全恢复在没有被褥的隔离笼中的加热垫;，这既确保小鼠等，更充分地提醒动物受伤，并防止意外吸入床上用品。当老鼠是完全移动和显示没有证据证明的醉，他们可以重新进入一个与其他老鼠的笼子。 2。嫁接日MPNST细胞注射液的制备在这个协议中，具体的数字细胞移植和移植后肿瘤生长所需的时代是我们有经验ST88 – 14细胞，是从5 NF1的相关肿瘤的一种常用的MPNST线确定。我们的嫁接使用的细胞已经包含一个巨细胞病毒荧光素酶- IRES -嘌呤磁带和克隆稳定表达萤火虫荧光素酶生物发光成像6所确定的慢病毒载体转导。我们还进行MPNST稳定与巨细胞病毒立即早期启动子的控制下表达萤火虫荧光素酶质粒转染细胞移植的实验。我们不建议这样做，因为我们发现，这些载体很容易经历表达以下嫁接的灭绝。 ST88 – 14细胞是生长在贝科的最小必要辅以10％胎小牛血清，10μg/ mL的链霉素和10国际单位/毫升青霉素（DMEM10）介质; 5微克/毫升嘌呤是还包括​​以保持慢病毒载体的选择。我们一直保持着这些细胞在我们的实验室为50通道，并没有观察到任何变化，在细胞生长在这些通道中的任何。 9 × 10 5 ST88 – 14细胞镀在T175烧瓶，增长了3天，在这一点烧瓶约80％融合。移植35小鼠，需要一个单一的80％汇合T175烧瓶，在这个密度，ST88 – 14细胞的平均收益率是7.3 × 10 6细胞每T175烧瓶。不得细胞增长到合流之前嫁接的收获，这是极为重要的。我们发现，嫁接细胞融合烧瓶程度较高的移植失败的结果和收获往往延长体内移植增长当然。 ST88 – 14细胞与室温汉克斯“平衡盐溶液冲洗一次。细胞从细胞剥线细胞分解解决方案为30秒至1分钟，在室温下使用的烧瓶。五毫升DMEM10（注： 不包括在这个媒介嘌呤）每人每毫升细胞用于剥线，然后加入到细胞。 使用血球细胞计数。 5 × 10 3 14 ST88 – 3μL悬浮细胞，将每鼠注射。一个移液与津贴细胞移植整个队列足够的数量，错误（例如，35只小鼠，我们通常移植40只小鼠细胞足够的数量转移），转移到无菌的1.5 mL试管。这些细胞是在5分钟3000转离心。小心取出上清液，细胞沉淀悬浮在DMEM10（注：嘌呤是不包括在这个媒介）到终浓度为5 × 10 3每3μL细胞。细胞置于冰上。 3。嫁接协议老鼠在异氟醚蒸发器的感应腔麻醉，直到他们不再撤回其后肢脚趾捏刺激。小鼠被放置在自己身边，和0.05毫克/公斤丁丙诺啡hydrocholoride皮下注入。麻醉，然后通过连续的异氟醚通过鼻锥交付的管理维护。请注意，安乐死的小鼠被用来证明这一点的视频程序，因此，油管，用于提供异氟醚异氟醚是在视频中不可见。 为了保持体温，动物在整个嫁接过程中的加热垫处理。为预防角膜干燥，眼药膏的小水滴（Puralube兽医药膏）的管理，以每只眼睛。由于这将是整个审判过程中被唯一确定每个鼠标所必需的，裁剪了一个独特的识别号码的耳标是每鼠右耳。 将动物胃，蔓延的后腿。鼠标盖，用无菌的悬垂性，揭露手术的窗口（侧面）移植会发生。无菌的悬垂性，应该允许可视化的头部，既保证了鼻子内锥，并允许监测呼吸和动物的颜色。优碘应用到手术部位用棉放倒撒施，开始在侧翼的中心，并逐步向外螺旋式手术窗口的边缘。 70％的乙醇，然后以同样的方式适用于手术部位。连续的优碘乙醇的应用程序重复两次以上。 取出细胞​​从冰，要么轻轻涡旋或轻弹管重悬落户细胞。使用吸管，去除3.2μL的细胞悬液，并退出到一块的封口膜。删除比需要的更多，放在封口膜暂停，我们可以确保有暂停无气泡，我们有一个完整的3μL注入。的细胞悬液多少可能拉入10μL汉密尔顿配备了33号针头的注射器。泡沫轻弹注射器和驱逐多余的细胞悬液，整整3μL。保持在冰上的细胞和细胞含注射器，直到准备使用;确保保持无菌针，不容许用冰或桶的接触。可以放在一块保鲜膜直接接触冰块冰注射器的顶端。 使用4号手术刀处理装备与第22号手术刀刀片，通过侧面的皮肤切口仅低于平行股骨;确保切口不超出手术擦洗领域的限制。打开皮肤切口，用手术钳或手动揭露底层肌肉。将会看到一个筋膜平面沿腿的长度;坐骨神经在于下面这两个相连的肌肉筋膜之间。用一双锐利的尖的剪刀，生硬的剖析，通过此筋膜暴露坐骨神经，这应该是一个粗线厚度为白色的线性结构明显。 用一双锐利的尖弯钳，仔细剖析下神经，从底层肌肉松动，这既提升和隔离神经。保留下的神经镊子保持这一地位。小心地插入神经汉密尔顿注射器的针头，试图保持尽可能的神经的同时注射的角度，因此，针不通过神经底部的穿刺。应插入针对远端的神经年底脊柱我们发现注射到肿瘤细胞对脊髓神经，建立了接近脊髓移植的肿瘤细胞。当发生这种情况时，肿瘤细胞往往侵入脊髓，导致早产的动物研究组因脊髓功能妥协的损失。 一旦针正确定位的神经，放松紧张的神经产生镊子，缓缓注入神经细胞从注射器超过45-60秒。它是必不可少的，这样做缓慢迅速驱逐注射器内容将导致在“反洗”周围注射部位的肿瘤细胞和他们的损失。所有的细胞已被成功地注入后，慢慢退出针注射材料，以尽量减少损失。 删除了牛肝菌和仔细回到原来的位置放置到其下的肌肉神经。 Vetbond手术胶关闭手术切口。保持约20秒钳切口，让胶水干。 鼠标是从异氟醚的鼻锥，并单独放置在一个床上用品，免费笼收回。这笼应保持在一个加热垫的顶部，直到动物已经完全康复。部分的回收笼，不应该在加热垫，这使得动物带走热量，如果他们太热情。以下嫁接，应定期评估动物嚼在现场，跛行或厌食;这些迹象可能表明，动物仍然在痛苦中，应给予适当的止痛药。在此过程中获得经验，我们发现30-40小鼠，可以很容易地在一个单一的一天嫁接。 4。嫁接成功，并随机进入研究组的评估生物发光成像是用来评估的嫁接过程中的成功。我们使用一个IVIS – 100系统（原精诺真，这是目前已知卡尺公司）检测肿瘤表达萤火虫荧光素酶作为其底物，D -荧光素的荧光素酶的化学反应产生的光发射。对这些图像进行分析，确定具体嫁接小鼠是否适合进入治疗试验同伙。在初步实验中，我们有量化的生物荧光信号探测，牺牲嫁接小鼠，收获与地区的利益，使用制造商的生活图像软件分析，生物发光信号的肿瘤和相关肿瘤的重量。这些研究表明，有一个肿瘤移植物重量和生物发光的光发射之间的线性关系，表明生物发光成像是一种评估整个临床前试验过程中移植瘤生长的合适的替代手段。通常，我们的形象，在同一时间5只小鼠。生物发光成像的更多细节， 察看了7。 为了评估移植成功，生物发光成像进行1天，3天后嫁接。图片收集小鼠在相同的位置，10分钟后腹腔注射2.5毫克的D -荧光素为导向。在成像过程中，老鼠都保持在异氟醚麻醉和自己的体温保持在37 ° C加热垫在精诺真成像。图像采集时间是在2秒至10分钟的范围内，确保没有像素图像采集过程中饱和的数据采集软件。肿瘤区域（相对光子计数/秒）的发光是利用精诺真专有软件。发光强度为代表的生物发光是重叠的黑白照片，是在同一时间收集的小鼠上的伪缩放。 要列入在临床前试验队列的资格，老鼠必须有一个检测的生物发光信号1和3天，嫁接后的生物荧光信号的强度必须增加1和第3天之间。有一个信号减少或静态的动物，被排除在外。此外，嫁接在同一天的小鼠中检测到的信号应该是为了彼此的幅度内1;与生物发光信号，是一个幅度低于或高于嫁接在同一天的动物检测的小鼠也被排除在外。 一旦小鼠已确定，符合这些标准，他们必须随机分为治疗组。要做到这一点，嫁接小鼠中检测到的荧光素酶信号嫁接后3天首次下令从最高到最低强度。小鼠，然后随机分配的力度，治疗组的顺序，扭转这个顺序，然后重复这个过程，直到所有的老鼠被分配到组，成组。例如，如果有4个治疗组小鼠（例如，安慰剂组和3个试验药物的浓度）被分配到各组的顺序1，2，3，4，4，3，2，1，1，2，3 4，4，3，2，1 ..等。在开始治疗之前，平均分配组的每个成员的生物发光检测信号，以确保所有组内的平均起点信号，是尽可能接近。候选治疗药物管理是在第3天开始。 为了评估治疗剂已移植在治疗过程中的增长上的效果，生物发光成像是一次开始治疗后的一周（10天，17，24，30后的嫁接）。对于非裸体的免疫缺陷小鼠，这是极为重要的动物再有新的毛皮增长与奈尔删除之前执行每个成像会议。这是因为头发块发光信号，与外套颜色决定多少的信号丢失。例如，苔白如发现瑞士Webster小鼠产生发光信号强度8的减少18％，而黑色的皮毛可以减少信号高达10倍9。我们还要注意，不能假设的，统一的毛皮再生会发生在所有治疗组和治疗组之间的“正常化”信号减少。这是因为治疗药物本身可能会影响头发生长。例如，我们已经注意到，他莫昔芬治疗抑制毛发再生，从而最大限度地减少安慰剂治疗的小鼠相比，认为本剂对肿瘤生长的效果。 ST88 – 14 MPNST细胞，小鼠就可以进行移植后30天。此时，肿瘤通常有成长为机构动物护理和使用委员会所允许的最大尺寸，必须牺牲。最终成像会议之后，小鼠死亡，治疗结果的进一步分析（例如，血液循环的治疗剂，重量测定肿瘤组织，组织学检查，Ki67的决心和TUNEL标记指数水平的决心和必要的标本收集生化指标的评估）。正是标本的收集将取决于实验设计的需要。 应每天监测与肿瘤的小鼠和终止，如果他们成为病（缺乏正常的疏导和避税行为），不能吃或喝，或若肿瘤过大，妨碍正常的身体运动。肿瘤的负担，不应该被允许超过10％的动物的正常体重。肿瘤重量为体重的百分比是比较荷瘤动物的年龄/性别匹配的对照组动物的体重的重量计算。恶病质不应该被允许成为临床意义。在荷瘤动物的重量损失不应超过正常体重的20％。 5。代表性的成果： 图1显示了典型的生物发光逐步增加观察1至18天，嫁接后在正确建立原位移植瘤裸第三研究院（NIH）鼠标（AC）。生物发光信号的量化观察嫁接后1-24天，虽然这些信号的逐步增加，肿瘤生长明显加速在研究期间的后期阶段（图1D）。要严格表明，肿瘤的生长发生在移植小鼠，我们定期收集坐骨神经，如果它出现，肿瘤已经破裂的外膜，并侵入邻近组织，周围的软组织和骨骼肌肉。鉴于MPNSTs积极的增长，这并不奇怪，我们常常发现，嫁接肿瘤细胞有违反正常的神经障碍，并侵入邻近组织（图1E）。我们也常常发现，嫁接MPNST细胞移植到神经嫁接部位的近端和远端积极。 第三鼠标美国国立卫生研究院的生物发光成像原位MPNST荧光素酶标记的细胞嫁接，移植后1天 （图1）。请注意，为了彼此的幅度内，所有的感兴趣区域（ROI）内检测到的信号在不同小鼠。重新制作映像10天（B）和18天（三）嫁接后的发光信号的显示，在个人小鼠移植网站逐步增加。 （四）图表说明在相对光子计数/ 1-24天嫁接后在嫁接部位发现的第二个逐步增加。 （五）从这个鼠标的嫁接部位的显微照片显示出肿瘤的生长，到邻近的骨骼肌和联络入侵。