高通量微RNA分析：优化复纳升秤定量RT - PCR Fluidig​​m公司动态ArrayTM国际金融中心

1。 RNA的提取：在单层细胞培育出 （按照制造商的协议，用TRIzol。） 试剂名称 公司 PROD /猫＃ TRIZOL解决方案 Invitrogen公司 15596-018 异丙醇 Sigma – Aldrich公司 1907年至1964年氯仿 Sigma – Aldrich公司彗星2432 乙醇核糖核酸酶自由水同质化均质直接在培养皿中的细胞，加入1毫升Trizol法解决方案，每10厘米的2盘面积，漩涡周围的Trizol法和吸管向上和向下的钢板，以确保全覆盖。 相分离孵育匀浆样品在室温下5分钟。 转移到一个标记管，加0.2毫升氯仿制成每1ml TrizolSolution管用手大力摇晃15秒。 在室温下孵育3分钟。 样品离心15分钟，在12000 XG 2 ° C。离心后的混合物分离成一个较低的相冲，一个相间和无色的上层水相，其中包含的RNA和总的Trizol溶液的体积应为60％。 RNA沉淀转让的水，含有RNA的阶段到一个新的，标记管。 每1毫升的Trizol溶液中加入0.5毫升异丙醇沉淀的RNA。 样品在室温下孵育10分钟。 2 ° C。离心10分钟，在12000 XG RNA洗离心后，弃管的上清液。 加入至少1毫升75％，每1毫升的Trizol溶液，涡旋乙醇洗涤RNA的颗粒（侧面和底部的管）。 2 ° C。离心5分钟，在7500 XG RNA的洗脱弃上清，再次离心1分钟。卸下过多的液体。 空气干燥颗粒为5-10分钟。 注：以上干RNA是难以溶解。 在核糖核酸酶自由水溶解沉淀吹打的解决方案和下孵育10分钟，在55 ° C。 测量RNA的浓度（A260/280的比值）使用Nanodrop™分光光度计。 储存在-80 ° C，直到准备使用。 2。 RNA的提取：血清 （以下mirVana巴黎工具包制造商的协议修改米切尔等。 ） 试剂名称 公司 PROD /猫＃ 评论 MIR瓦纳巴黎套件 2X变性解决方案酸酚：氯仿 miRNA的清洗解决方案1 miRNA洗涤液的2 / 3 Ambion公司 AM1556 修改协议 2 – 巯基乙醇 Sigma – Aldrich公司 M7522 乙醇 DEPC处理水化学制备： 2 – 巯基乙醇的加入375μL2X变性液，拌匀。 21毫升100％的乙醇添加到miRNA的洗涤液1。 100％的乙醇添加40毫升的miRNA洗涤液的2 / 3。 样品制备： 在冰上解冻血清样本。 同质化混合2X变性液等体积（300μL）（应在室温下）和旋涡300μL的样品。 孵育5分钟，冰的混合物。 添加量的酸酚：氯仿等于样品裂解液加2X变性液（600μL）的总体积。 重要提示：不要使用缓冲溶液在于顶部的酸酚：氯仿。 旋涡混合60秒。 在室温下离心15分钟最大转速（> 10,000 XG）。离心后，上层水相，相间和较低的有机相的混合物分离成。 删除aque类层之上（300 – 500μL，包括任何proteinacious的“朦胧”层）。 像以前一样重新提取水层，再加入氯仿。 重要信息：第二次提取的水层是常规体积小（250μL） 。注意卷的恢复。 终审RNA隔离（总RNA的制备） 预热（95℃）无核酸酶水。 100％的乙醇必须在室温下。 最后RNA隔离（总RNA） 1.25卷100％的乙醇添加到回收的水相（例如，如果被收回300μL，加入375μL乙醇），调匀。 对于每个样本，放入收集管中的一个滤芯。 滴入的过滤器在裂解。 离心机（10,000 XG），30秒，丢弃流过，再次离心30秒到同一个收集管和更换滤芯。 RNA洗应用700μLmiRNA的清洗液1滤芯和离心15秒，丢弃收集管流过，并更换成相同的收集管滤芯。 申请为15秒500μL的miRNA洗涤液的2 / 3，离心，丢弃的流量通过，并重复第二个500μL洗涤液的2 / 3。 弃掉1-2分钟流过干自旋。 放置在一个新的收集管滤芯，适用于100μL核糖核酸酶自由水（95℃），接近第2分钟孵化。 离心1〜2分钟恢复的RNA。 贮存于-80℃直至使用。 3。浓度RNA解决方案（5X） （以下制造商的协议） 试剂名称 公司 PROD /猫＃ 单片机离心式过滤装置，Ultracell YM – 3 Millipore公司 42404 DEPC处理水 设备：单片机Ultracell YM – 3，截止SS和DS核苷酸：10 体积：所需的重新集中RNA溶液的体积是依赖于实验设计，并应包括对照实验。 插入小瓶单片机样品水库和水库移液器解决方案。 注：请勿触摸膜。 185分钟离心机在4 °最大14000 C X G. 注：位置对转子与打击乐队的小瓶。 移液器核糖核酸酶自由水所需的量（如20μL）上水库，水库的地方倒到一个新的瓶和3分钟旋转4 ° C最大3000小工贮存于-80℃直至使用。 4。反转录 （由唐等协议。进行了修改。） 试剂名称 公司 PROD /猫＃ 评论 高容量的cDNA归档套件 10倍的cDNA归档缓冲区的dNTP（100毫米） 莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV） 逆转录酶（50 U /μL） 美国应用生物系统公司 4368814 修改协议 RNaseOUT（40 U /μL） Invitrogen公司 10777019 X – plex的反向茎环结构的引物组合（40纳米）* 综合DNA技术自定义序列* DEPC处理水反应体积：5.5μL 注：最终的茎环结构的引物浓度应1-5纳米（2纳米）。 准备主混合（每反应体积）如下： 1。 DEPC -水 1.959μL 2。 10X RT -缓冲区 0.55μL 3。核糖核酸酶抑制剂（40 U /μL） 0.0715微升 4。的dNTP（100毫米） 0.275μL 5。 X – plex的反向茎环结构的引物组合（40纳米）* 0.275μL 6。 MMLV RT（50 U /μL） 0.369μL 宓X和短暂离心。 2μL样品添加3.5μL主混合。 执行以下的RT反应： 16℃30分钟，由60个周期，在20 ° C 30秒，42 ° C为30秒，50 ° C为1秒，最后85 ° C时5分钟灭活MMLV – RT，4 ° C∞ 。 储存在-20 ° C，直到使用。 *反向的茎环结构的引物名单可以发现在http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 5。预扩增（预PCR） （由唐等协议。进行了修改。） 试剂名称 公司 PROD /猫＃ 评论 的dNTP（100毫米） 美国应用生物系统公司 4368814 高第。 cDNA的归档包。 2个通用PCR扩增预混试剂NoAmpErase UNG 美国应用生物系统公司 4324018 X – plex的正向引物组合（450纳米）* 综合DNA技术自定义序列* 通用反向引物（100微米） 综合DNA技术自定义序列2 AmpliTaqGold聚合酶（5 U /μL） 美国应用生物系统公司 4311806 MgCl 2的 （100毫米） DEPC处理水 反应体积：27.5μl（22μlMM +5.5μlRT -产品） 注：前置放大是必要的，以提高信号强度，尤其是当起始RNA浓度是有限的。输入RNA水平决定前PCR循环的最佳数量。由于相同的相对效率，每个PCR循环最终产品的浓度增加一倍。由于一些miRNA将更加高效表达，避免过度骑自行车。然而，在放大，可能会导致检测灵敏度的损失，尤其是在低水平表达的microRNA。 12预扩增循环，使用100ng的总RNA，在我们的手中出现足够了。使用作为起始原料，经12个周期结果在检测的miRNA的水平，但15个周期似乎要优于血清。最后，3卵母细胞（约400 PG每个卵母细胞3的总RNA），16预扩增周期的开始，成功地使我们屏幕上的microRNA的表达水平4。 *正向引物名单，可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 准备主混合（每反应体积）如下： 1。 2个通用MM 13.75μL 2。 DEPC -水 0.792μL 3。 MgCl 2的 （100毫米） 0.55μL 4。的dNTP（100毫米） 1.1μL 5。 X – plex的正向引物组合（450纳米） 3.06μL 6。通用RP（100μmol） 1.375μL 7。 AmpliTaqGold聚合酶（5 U /μL） 1.375μL 混合，短暂离心。 加入22μL法师组合，以每5.5μLRT – 产品。 执行以下预PCR反应： 95℃10分钟，55 ° C为2分钟，10 – 18 95 ° C的周期为1秒和65 ° C为1分，4 ° C∞。 6。前- PCR产物的纯化 10％的原生聚丙烯酰胺凝胶净化大小选择 试剂名称 公司 PROD /猫＃ 40％丙烯酰胺/双解决方案 Bio – Rad公司 161-0144 TEMED Bio – Rad公司 161-0801 10 bp的DNA阶梯 Invitrogen公司 10821-015 SYBR黄​​金核酸凝胶染色 10,000 ×集中在DMSO Invitrogen公司 S11494 糖原（20毫克/毫升） 罗氏公司 10 901 393 001 缓冲器EB 10％Ammoniumpersulfate（APS） 10缓冲区 6X橙G DEPC处理水 ddH2O A.凝胶法制备为了使10％的聚丙烯酰胺的混合物添加10毫升 1。 DDH 2 Ø 6.5毫升 2。 10X TBE 1毫升 3。聚丙烯酰胺（40％） 2.5毫升 4。 APS（10％） 80μL 5。 TEMED 4μL 准备DNA梯状： 0.5μL10 bp的DNA阶梯 4.5μL缓冲液（EB） 1μL6X橙G 每27.5μL预- PCR产物5.5μL6X橙G。 B.运行凝胶与150V运行55-60分钟的凝胶。 注：溴酚蓝为指示剂，用20bp区域运行。 C.染色凝胶摇床25分钟的凝胶染色使用SYBR金。 注 ：SYBR的黄金对光敏感。 D.切割凝胶切出60-80 BP前PCR产物带，并转移到标记管。 注：为低RNA输入预PCR产物带可能不可见。 粉碎凝胶带（如管离心管）。 E.重新提取的cDNA 加入300μl10缓冲区在37 ° C时4小时的肩。 一个标记收集管传输流体，添加另外300μL10缓冲区凝胶含管孵育4 ° C在肩过夜。 吸剩下的液体，转移到标记之前收集管，并注意总回收量。 F.乙醇沉淀室温100％的乙醇添加3卷。 添加0.5μL糖原（20毫克/毫升）。 涡街流量计。 干冰放置至少2小时，或在-80 ° C过夜。 自旋在4 ° C离心30分钟以沉淀的cDNA在。 转储液，添加700μL室温75％乙醇和10分钟的旋转。 转储液和自旋为5分钟。 吸了10分钟，而不会干扰颗粒和空气干燥上清。 干净的水溶解沉淀。 注：集中cDNA的解决方案所需的量依赖于实验设计应包括对照实验。 7。前- PCR产物的纯化其次是引物酶消化纯化离心柱（制造商协议） 试剂名称 公司 PROD /猫＃ ExoSAP – IT USB – Affymetrix公司 78250 MinElute PCR纯化试剂盒 Qiagen公司 28004 注：独家酶清理成功切除引​​物在我们手中，但也导致了部分降解的预扩增产物，可能是由于部分短的产品随着温度升高80 ° C时的灭活步骤变性酶。避免热灭活和使用离心柱从酶反应的PCR产物直接净化删除任何无产品退化的底漆。 5μL后的PCR产物与2μLExoSAP – IT混合。 37 ° 15分钟，以降低其余的引物和核苷酸的彗星。 加入5的缓冲PB卷1体积的PCR反应和混合，如果pH值指示剂，我已添加到缓冲器PB，检查混合物的颜色是黄色。 在提供的2ml收集管放置在一个合适的机架的MinElute列。 应用范例MinElute列和1分钟的离心。 流丢弃，MinElute列到同一管内，并添加750μL缓冲体育MinElute列洗1分钟离心机。 丢弃流过，并在同一管内放置MinElute列回。离心机以最大的速度增加1分钟列。 放置在一个干净的1.5 ml离心管的MinElute列。 以洗脱DNA，加入10μLDEPC处理水的膜的中心，让站在列1分钟，然后CENtrifuge为1分钟。 8。 Fludigim 96.96 QRT – PCR分析 试剂名称 公司 PROD /猫＃ 评论 Fluidigm公司96.96动态阵列套件 96.96动态阵列 96.96控制线液 20X载入试剂 Fluidig​​m公司混合的通用反向引物（1μM） 正向引物（1μM） TaqMan探针（0.2微米） 综合DNA技术自定义序列（1） 2个通用PCR扩增预混试剂 NoAmpErase UNG 美国应用生物系统公司 4324018 吐温 1。促发的96.96动态阵列国际金融公司注入到每个芯片上的累加器的控制线液（150μL）。 将进入国际金融公司（集成流体通路）控制器芯片和运行总理（136x）脚本到芯片的控制线液总理。 注：芯片需要使用24小时后打开包装。请务必不要对泄漏物控制线液，因为控制芯片上，或在进气口线流体使芯片无法使用。芯片需要吸60分钟内加载。 2。准备样品 2.1前的样品制备在一个一次性的塑料管，结合下面的表格，使样品预混合（每进气道卷）的组成部分。 2X的TaqMan通用的master mix 2.5μL 20X载入试剂 0.25μL 注：最终成交量为2.75μL，为移液器盘盈免除损失 2.2样品制备在96结合以及格式每个样品与样品预混合（每进气道卷）。 前样品混合 2.75μL 样品 2.25μL 注：涡和离心96孔板中，简要地收集液。 每个入口5μL的最后一卷，吹打考虑损失准备成交量略高。 2.3准备13X检测使用96孔板准备13X检测。 1X浓度在下面的表格，规模达13倍。 通用反向引物 1微米（1个） 2序列正向引物* 1微米（1个） * 基因特异性的TaqMan探针＃ 0.2微米 ＃ *正向引物名单，可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm ＃TaqMan探针的名单可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 在浓度为0.25％，最终吐温吐温13X检测一个新的96孔板等分结合 注：每个入口的最终体积为5μL，准备足够的体积（5.5μL）期间损失量转移到。 拌匀，避免气泡，短暂离心收集液。 3。载入芯片 注：为了使样品和检测，确保芯片的正确定位正确加载。很方便的槽口对准左上角。 确保所有检测样品溶液混合，然后再加载芯片。这是方便做在96孔板和旋转，然后再加载芯片板。注意芯片的吹打，以供日后参考地图。 未使用的示例入口处应填2.75μL样品混合和2.25μLDNA自由水。 应填写未使用的检测进气口与2.5μL检测装载试剂和2.5μl水。 不要走过去的第一站，同时吹打，以避免引入气泡。 加载样品和检测（五后olume每个入口：5μL）运行负载混合脚本（136x）脚本来加载到芯片的样品和检测。 脚本已经完成后，删除从ICF控制器芯片。 剥离加载芯片底部的蓝色保护膜。 删除任何从芯片表面的灰尘颗粒或碎片。 4。 96.96定量RT – PCR检测 BioMark系统传输芯片，并使用以下的扩增条件： 55℃2分钟，95 ° C为10分钟，40个周期为95 ° C为1分15秒和55℃。 按照制造商的数据采集软件的协议。 5。使用的qPCR分析软件经过RT – PCR技术的专有软件提供的扩增曲线，每口井的热图和CT值。请参阅数据分析软件手册。 9。代表性的成果： 图1。图解实验的工作流程。所示是一个一步一步的多重定量RT – PCR协议的描述，包括从多重反转录（步骤C）和多路前置放大器的过度引物的净化（步骤E）（步骤d）前实时检测（步骤F），在纯化的QRT – PCR的cDNA模板。 FP：microRNA的具体正向引物，URP：通用反向引物，R – SLP：小分子RNA的特定反向茎环结构的引物。 点击这里为一个较大的图像。 图2。聚丙烯酰胺凝胶净化。QRT – PCR的模板后前 PCR – PCR产物的大小乐队专门在WT样本，但没有microRNA的缺陷DGCR8 – / -或Dicer酶- / -样本（箭头）后96复杂RT和12周期的前置放大。请注意，非特定产品来源不明（箭头）和过量引物在所有样本中发现（星级）。 图3。净化多重前置放大后，大大提高了定量RT – PCR结果的精度比较的相对表达水平的WT MESC）DGCR8 – / – （缺乏规范的microRNA）MESC揭示1）更多的小分子RNA的检测和2）假阳性的损失/ – -在DGCR8信号的背景后，净化了引物- PCR产物。二）经纯化后，双方DGCR8的相对表达水平- / – / WT 和 Dicer – / – / WT显示假阳性信号的损失，并允许适当的分类罕见DGCR8 独立/ Dicer的依赖性小分子RNA（miR – 320的， – 484，-877）5。 图4。 Fluidigm公司的高通量定量RT – PCR检测miRNA表达谱。屏幕截图96.96 Fluidigm公司QRT – PCR mircoRNA分析屏幕为前列腺癌患者血清miRNA的水平的改变。实时定量PCR分析软件提供的扩增曲线，色码热图和循环阈值（CT）。