Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

1. Preparazione dei reagenti Reagenti da utilizzare in tutta l'esperimento deve essere preparato prima di iniziare il protocollo chirurgico. Si noti che tutte le soluzioni sono state effettuate utilizzando una tecnica sterile. Soluzione fisiologica salina (PSS) è meglio preparato in due componenti: la soluzione di base sale e bicarbonato di sodio. Preparare entrambe le soluzioni a concentrazione 20X e conservare a 4 ° C. Bicarbonato di sodio a 20X è 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) e soluzione salina di base a 20X concentrazione è 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), e 23,4 mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Le soluzioni devono essere preparate in dH 2 O e sostanze chimiche devono essere aggiunti uno alla volta e mescolate fino a quando la soluzione è chiara prima di aggiungere il successivo chimica Preparare 2L di PSS diluendo volumi uguali di bicarbonato di sodio e di soluzione salina di base e diluito a concentrazione 1X (per due 2L di PSS diluire 100 ml di ogni soluzione di bicarbonato di sodio e sali di base in dH 2 O Luogo matraccio 2L contenente PSS e PSS in acqua a 37 ° C bagno. Equilibrare la soluzione con il 5% di CO 2 / gas azoto equilibrio per 1 ora prima dell'inizio della procedura chirurgica. Prodotti chimici vasoattivi (es. fenilefrina, l'acetilcolina, nitroprussiato di sodio) sono meglio preparati a concentrazione 1M in dH2O e conservati in 100μl aliquote a -20 ° C. 2. Preparazione degli animali Determinare il peso del mouse e somministrare la dose iniziale di sodio pentobarbital a 90mg/kg mediante iniezione intraperitoneale. Nel corso della procedura il mouse è continuamente monitorato per il piano di anestesia attraverso pizzico punta e attento esame della frequenza respiratoria. Ulteriori iniezioni di sodio pentobarbital deve essere somministrata, se necessario a 20mg/kg per mantenere aereo anestesia. L'aereo chirurgico di anestesia viene mantenuta in conformità con le normative federali e istituzionali, come indicato nel protocollo di cura degli animali approvato dalla cura degli animali e del Comitato uso (ACUC) della University of Northern aC. Rimuovere i capelli dalla zona addominale e fianchi / hip da rasoio. Eliminare le rimanenti capelli sciolti da tampone imbevuto di alcool e picchiettando l'area con del nastro adesivo. Questo è sufficiente come questa procedura sperimentale è terminale. Posizionare il mouse su un bordo chiaro chirurgico in posizione supina e collegare il mouse al bordo con nastro adesivo ogni zampa alla scheda. La temperatura corporea è mantenuta attraverso una lampada di calore esterno e monitorati tramite termometro rettale per garantire che l'ipotermia non si verifica a causa di anestetico. 3. Procedura chirurgica Durante l'intera procedura chirurgica garantire tessuti esposti è sempre tenuto superfused con equilibrata soluzione PSS riscaldata. E 'anche importante fare mai il contatto con la vascolarizzazione di interesse con strumenti chirurgici o danneggiare i vasi mettendo a molta forza su di loro attraverso la manipolazione del tessuto adiposo e del tessuto connettivo che li circonda. Posizionare il mouse nell'ambito di applicazione dissezione. Fai una incisione lungo la linea mediana della superficie ventrale della cavità addominale e ritrarre la pelle in direzione della colonna vertebrale del mouse. Una volta che la pelle è ritratta in modo che la LN è facilmente visibile, la pelle perno su un piedistallo trasparente Sylgard 184. Rimuovere il sottile strato di tessuto connettivo sovrapponendo l'area intorno alla LN Chiara la sovrapposizione del tessuto adiposo e circondano il linfonodo finché il letto microvascolare è esposto. Il segmento principale arteria stabilisce adiacente alla LN ed è comunemente sovrapposto dal venule. L'intervento intero dura circa 30 minuti. 4. Imaging e Vessel Analysis Una volta che il segmento del vaso di interesse è esposto nell'ambito di applicazione dissezione, fissare il preparato sul microscopio intravitale. Si noti che animale rimane sul tabellone chiaro chirurgico, mentre il microscopio intravitale per tutta la durata dell'esperimento. La temperatura corporea è mantenuta attraverso lampada di calore e di misura mediante termometro rettale, come descritto nella sezione chirurgica. L'aereo anestesia è inoltre monitorato in tutto l'esperimento, come descritto nella sezione 2.1. Impostare il superfusione e le linee di aspirazione. Superfusione di PSS avviene a gravità da un serbatoio, nel serbatoio camicia d'acqua riscaldata (la giacca viene fatta circolare acqua e riscaldata dal bagnomaria circolante) di essere irrorati dal 5% di CO 2 di azoto equilibrato, e giù una linea a goccia ad una velocità di 10 ml / min. Una linea di aspirazione deve essere usato per continuare tirare PSS superfused dalla preparazione. Da notare che prima della sperimentazione le linee di aspirazione e camicia d'acqua sono accuratamente puliti e conservati dopo ogni esperimento. Questo assicura sterilità prima del prossimo esperimento. Controllare la temperatura del PSS superfusing. Regolare la temperatura delcircolazione bagnomaria e / o il tasso di superfusione PSS per raggiungere una temperatura di circa 37 ° C in tutta la preparazione. Lasciare che la vascolarizzazione a equilibrare con PSS per almeno 60 minuti e quantificare il diametro del vaso con la pinza video. Tipicamente, diametro del vaso deve essere determinata in più punti (ad esempio, a 40, 50 e 60 minuti) per garantire la nave si è stabilizzata. Valutare la salute della nave che utilizza un agonista della muscolatura liscia specifici (es. fenilefrina, PE) ed un agonista endotelio specifiche (es. acetilcolina, ACh). Concentrazione di agonista deve essere regolata a seconda della agonista, ma per PE e Ach la nave dovrebbe essere valutata per ogni concentrazione di oltre cumulativa (10-5M a 10-9M) al superfusate. Ogni applicazione agonisti devono essere separati da una fase di lavaggio (di solito 30 minuti) utilizzando PSS fino a quando la nave ritorna al diametro di riposo. In seguito alla valutazione della salute dei vasi sanguigni, le successive farmaci vasoattivi, etichettatura fluorescenti e celle tracciamento esperimenti possono essere condotti. Dopo la fine dell'esperimento l'animale viene data una dose eccessiva di sodio pentobarbital. L'animale viene poi monitorato per assicurare che non c'è risposta a pizzico punta e la mancanza di movimenti respiratori o di battito cardiaco. Nel momento in cui questa è seguita da dislocazione cervicale. 5. Rappresentante dei risultati: Dopo il periodo di equilibrio della preparazione dovrebbe produrre un'immagine chiara che permette l'identificazione sia delle arteriole e venule che fornisce il nodo inguinale linfa. Ci dovrebbe essere cellule adipose minimo circostanti i vasi per consentire pareti della arteriole e venule essere chiaramente osservato per le pinze video da sovrapposte per calcolare diametro del vaso. Il punto integrante di una preparazione di successo is l'arteriola ha una ricca offerta di sangue si muove attraverso il lume e che ci sia un grado significativo del tono vascolare (cioè l'arteriola ha la capacità effetto vasocostrittore e vasodilate alla muscolatura liscia ed endoteliali agonisti specific rispettivamente) . Figura 1. Immagine microscopia intravitale di linfonodi inguinali alimentazione arteriola nodo (freccia rossa) che alimentano il linfonodo equilibrata con soluzione fisiologica e che corre lungo il lato venule principale (freccia verde). Figura 2. Normale risposta vasoattivi per fenilefrina superfused (PE) con l'aggiunta cumulativo di soluzione fisiologica dalle concentrazioni 10 -9 M per 10 -5 M. La presenza di una vasocostrizione robusta è indicativa di normale funzionamento della muscolatura liscia presente nella arteriole. Figura 3. Normale risposta vasoattivi per superfused acetilcolina (ACh) con l'aggiunta cumulativo di soluzione fisiologica da concentrazioni di 10 -9 M per 10 -5 M. La presenza di una vasodilatazione robusta è indicativa della normale funzione endoteliale presente nelle arteriole.