Att studera integration av vuxna födda Neuroner

1. Virus Injection Hög titer konstruerad retrovirus (1 × 10 9 enhet / ml) är producerad av co-transfektion av retrovirala vektorer och VSVG in HEK293T celler, följt av ultracentrifugering av viral supernatant. För källor och produktionsmetoder, se den utmärkta JUPITER demonstration (3). OBS: Unga vuxna (4-6 veckor gammal) hona C57BL / 6 möss (Charles River) är inhysta under normala förhållanden. Alla förfaranden följer det nationella Vetenskapsrådets guide för vård och användning av försöksdjur i ett protokoll som godkänts av Stony Brook University IACUC. Tina 2ul av frysta retrovirus per djur på is. Bedöva (100 mikrogram ketamin + 10 mikrogram xylazin per gram kroppsvikt) och montera djur på en stereotaxic ram (Steolting). Ta bort hår på huvudet och torka av huden med 70% etanol. Avslöja skallen och borra fyra grunda hål med en Tandläkarborrmaskiner (0,6 mm borr) på följande koordinater: anterioposterior = -2 mm från bregma; sidled = ± 1,6 mm, ventral = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm från bregma; sidled = ± 2,6 mm, ventral = 3,2 mm. anterioposterior = -2 mm från bregma; sidled = ± 1,6 mm, ventral = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm från bregma; sidled = ± 2,6 mm, ventral = 3,2 mm. Montera en 1μl Hamilton, platt-tip spruta och injicera 0,5 l retrovirus per plats med en hastighet av 0,25 l / min i dentate gyrus. (Se ovan koordinaterna för ventrala djup.) Paus 2 minuter efter varje injektion innan långsamt dra tillbaka i sprutan för att förhindra att vätskan rinner tillbaka. Mellan injektionerna, kortfattat skölj utsidan av sprutan med steril PBS och en applikator för att avlägsna spår av blod. Stäng såret med sterila kirurgiska suturmaterial (typ P-1, storlek 6-0) och tillbaka djuret till standard bostadsförhållanden tills önskad tid stadierna efter injektionen. 2. Slice Förberedelser För att få hög kvalitet akut skivor från vuxna möss använder vi en modifierad lösning för kapning för bit beredning (se nedan). Pre-chill lösning för kapning till 0-4 ° C på is och bubbla med 95% O 2 -5% CO 2 i minst 30 minuter. Bedöva och transcardially BEGJUTA ett djur med iskall syremättat lösning för kapning. Snabbt bort hjärnan i en Petri-skål med filter-papper pre-fuktad med kallt, syrerikt lösning för kapning. Skär av lillhjärnan och skiva en monteringsyta minst 1 mm främre till (synliga) injektion koordinater. Limma hjärnan på en vibrotome scenen och montera in den i klippkammare fylld med kallt och syrerikt lösning för kapning. Förbered koronalt eller horisontella skivor (300-350μm) och för över dem med en stor bar pipett till en inkubering kammare som innehåller rumstemperatur ACSF bubblade med 95% O 2 / 5% CO 2. Inkubera skivor, bubblande kontinuerligt, vid 32 ° C i 30-60 minuter. Återgå kammaren till rumstemperatur under hela inspelningen. 3. Elektrofysiologiska experiment Segment överförs till inspelningen kammare som kontinuerligt perfusion med syremättat ACSF vid 32 ° C – 34 ° C. En bipolär volfram stimulering elektrod placeras i den molekylära lagret av dentate gyrus använda en låg målsättning förstoring mikroskop (10X). Nyfödd DGCs i sub-granulat zon / granulat cellager identifieras genom uttryck av GFP eller dTomato. Helcells-patchclamp inspelning sker på nyfödda nervceller under hög förstoring (40x). Firing egenskaper inspelade celler erhålls genom injektion av en serie av strömmar enligt nuvarande-clamp läge. Elektrisk stimuli levereras av stimulering elektroden via en stimulering frånskiljare kontrolleras av inspelningsprogram, och väckte postsynaptiska strömmar i det nyfödda DGCs registreras. 4. Data Analysis Amplitud av evoked postsynaptiska svaren analyseras på olika utvecklingsstadier av vuxna födda nervceller. 5. Representativa resultat Med hjälp av ovanstående protokoll är GFP uttryck i nyfödda dentate gyrus nervceller liknande figur 1 vanligt. Observera att nyfödda nervceller är enkelt visualiseras och både dendriter och axoner är kraftigt märkta. Uttryck i tunna DGC axoner och små taggar beror på kvaliteten och titer av viruset, promotorn som används och längden på in vivo-uttryck. I våra händer, nyfödda celler och sub-cellulära organeller är oftast synliga inom några dagar efter injektion, och ryggrad uttryck kan spåras från de tidigaste stadierna av utveckling. Whole-cell inspelningar från nyfödda nervceller vid olika tidpunkter stadier möjliggöra studier av unika nyfödda cellens egenskaper, t.ex. potentialer åtgärder (figur 2a), liksom arbetet med synaptiska integrering i befintliga nervbanor vid mognad (Figur 2b). Figur 1 2-fotonen konfokala bild av nyfödda nervceller i ett horisontell dentate gyrus avsnitt av en vuxen mus. Gröna celler 21dpi (dagar efter injektionen) GFP-uttryckande nyfödda DGCs märkta med pUX-GFP retrovirus. Figur 2 a) Åtgärd potentiell bränning egenskaper hos en nyfödd DGC på 21 dpi. B) representativa framkallat excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) inspelade på en nyfödd DGC vid 21 dpi.