成人出生的神经元的整合研究

1。病毒注射高滴度工程逆转录病毒（1 × 109单位/毫升）是由逆转录病毒载体共转染HEK293T细胞，成由病毒上清离心VSVG。来源和生产方法，看到优秀的Jove示范（3）。 注：年轻成人（4-6周龄）雌性C57BL / 6小鼠（查尔斯河）是在标准条件下安置。所有的程序都遵循美国国家研究理事会的大学石溪分校IACUC批准了一项协议下的实验室动物护理和使用指南。 每头牲畜被冻结的逆转录病毒在冰上解冻2ul。 麻醉（100微克氯胺酮+每克体重10微克甲苯噻嗪）和安装在立体定位框架（Steolting）的动物。删除在头上的头发和皮肤用70％乙醇擦拭。 暴露的颅骨钻4个浅孔使用一个牙钻（0.6毫米钻头）在下面的坐标： anterioposterior = -2毫米;从囟外侧= ± 1.6毫米;腹= 2.5毫米; anterioposterior =囟-3毫米;横向= ± 2.6毫米;腹= 3.2毫米。 anterioposterior = -2毫米;从囟外侧= ± 1.6毫米;腹= 2.5毫米; anterioposterior =囟-3毫米;横向= ± 2.6毫米;腹= 3.2毫米。 登上一个加入1μl汉密尔顿，平头注射器注入到齿状回率在0.25μL/ min的0.5％μL逆转录病毒网站。 （见上述腹侧深入的坐标。）暂停2分钟，每次注射后，才慢慢退出注射器，以防止流体倒流。注射之间，简单地冲洗外表面用无菌PBS的注射器针尖和撒施去除血迹。 关闭伤口用无菌手术缝合材料（型号P – 1型;尺寸6-0），并返回所需的时间阶段，直到注射后动物标准的住房条件。 2。切片的制备为了获得高品质的成年小鼠急性片，我们使用切片准备修改后的切割解决方案（见下文）。 前寒意裁剪解决方案，以0-4 °上冰和95％的泡沫的C = O 2 -5％ 的 CO 2为至少30分钟。 麻醉和transcardially灌注冰冷的氧饱和切削液的动物。 滤纸与寒冷，含氧的切削液预湿，迅速取出培养皿盘的大脑。切断小脑和片安装表面至少1毫米前（可见光）注射坐标。胶的大脑上一个vibrotome台阶，并安装到它切割室充满了寒冷和含氧切割解决方案。 准备冠状或横向切片（300 -350μm）和大口径的吸管转移到孵化室含室温学联95％O 2 / 5％的CO 2气泡。 片，不断冒泡，在32 ° C孵育30-60分钟。返回会议厅，录音时间室温。 3。电生理实验片被转移到录音室，这是连续灌注与氧饱和学联在32 ° C – 34 ° C。 双极型钨刺激电极放置在使用低倍率的显微镜物镜（10X）的齿状回分子层。 在新生儿DGCs分粒状区/颗粒细胞层表达GFP或dTomato确定。在高放大倍率（40X）下的新生神经元进行全细胞patchclamp记录。 射击细胞的属性得到了一系列的电流注入电流钳模式下。 电刺激刺激电极通过录音软件控制的刺激隔离的交付，并记录在新生儿DGCs引起突触后电流。 4。数据分析成人出生的神经元的不同发育阶段的分析，引起突触后反应的振幅。 5。代表性的成果使用上述协议，是常见的绿色荧光蛋白的表达在新生儿的齿状回神经元与图 1类似。请注意，新生的神经元易于可视化和强劲标记树突和轴突。在薄的DGC轴突和小刺的表达依赖于质量和滴度的病毒，促进剂，在体内表达的长度。在我们的手中，新生细胞和亚细胞器通常可见注射后几天内，脊柱的表达，可以追溯到从发展的早期阶段。 W孔在不同的时间阶段的新生神经元细胞的录音让新生细胞的独特属性，如动作电位（ 图2a），以及突触融合的过程中成熟（图2b）期间的研究到现有的神经回路。 图1 2 -光子共聚焦图像，新生神经元在一个水平的成年小鼠齿状回部分。绿色细胞21dpi（天注射后）绿色荧光蛋白表达与pUX – GFP逆转录病毒标记的新生DGCs。 图2）动作电位射击一个新生DGC的属性在21 DPI，B）代表诱发兴奋性突触后电流（EPSCs）记录在一个新生儿在21 dpi的DGC。