Summary

Metoder för snabb överföring och lokalisering av Borrelia Patogener Inom Tick Gut

Published: February 14, 2011
doi:

Summary

Borrelia studier kräver ofta generering av fästingar infekterade med patogenen Borrelia burgdorferi, en process som normalt tar flera veckor. Här visar vi ett mikroinjektion-baserat förfarande kryssa infektion som kan uppnås inom några timmar. Vi visar också en immunofluorescens metod för in situ lokalisering av B. burgdorferi inom fästingar.

Abstract

Borrelia orsakas av infektion med spirochete patogenen Borrelia burgdorferi, som upprätthålls i naturen av en fästing-gnagare infektion cykel 1. En fästingburna murin modell 2 har utvecklats för att studera borrelia i laboratoriet. Medan naiva fästingar kan vara infekterade med B. burgdorferi genom att utfodra dem på infekterade möss tar ömsat processen flera veckor till månader att slutföra. Därför är utveckling av snabbare och effektivare metoder fästing infektion, till exempel en mikroinjektion-baserat förfarande, ett viktigt verktyg för studiet av borrelia 3,4. Förfarandet kräver bara timmar för att generera infekterade fästingar och tillåter kontroll över leverans av lika mängder av spiroketer i en kohort av fästingar. Detta är särskilt viktigt eftersom den generation av B. burgdorferi infekterade fästingar av naturliga utfodring processen med hjälp av möss som underlåter att garantera 100% smittade och eventuellt resulterar i variation av sjukdomsalstrande bördan mellan matas fästingar. Dessutom kan mikroinjektion användas för att infektera fästingar med B. burgdorferi isolat i de fall då en försvagad stam är oförmögen att etablera infektion hos möss och kan därför inte vara naturligt förvärvas av fästingar 5. Denna teknik kan också användas för att leverera en mängd andra biologiska material till fästingar, till exempel specifika antikroppar eller dubbelsträngat RNA 6. I denna artikel kommer vi att visa mikroinjektion av nymphal fästingar med in vitro-odlade B. burgdorferi. Vi kommer också att beskriva en metod för lokalisering av borrelia patogener i fästingen tarmen med hjälp av konfokal immunofluorescens mikroskopi.

Protocol

1. Mikroinjektion av Nymphal Ixodes scapularis Fästingar 1. Förbereda nålar Tillverka flera mikroinjektion nålar genom uppvärmning och dra 1 mm glas kapillärrör (World precisionsinstrument) i ett glas mikropipett avdragare enhet (Narishige). Ta försiktigt bort den bräckliga kapillärrör. Store drog nålar (med spetsen uppåt) på tejp i en petriskål. 2. Förbereda B. burgdorferi Väx B. burgdorfer…

Discussion

Här visar vi ett mikroinjektion-baserat förfarande för snabb och effektiv infektion av nymphal Ixodes fästingar med bakteriell patogen B. burgdorferi. Vi beskriver också en konfokala immunofluorescens förfarande för detektion av B. burgdorferi i fästingen tarmen på plats. Trots att vår demonstration innebär nymphal tarmen, liknande förfaranden gäller också för andra utvecklingsstadier av fästingar, som larv eller vuxna 8,9. Men på grund av sin storlek kan tekniken v…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar uppriktigt medlemmar i Pal laboratorium för hjälp med utarbetandet av denna demonstration. Denna studie stöddes av PHS bidrag AI076684 och AI080615 från NIH / NIAID.

Materials

Material Name Typ Company Catalogue Number Comment
Glass capillary tubes   World Precision Instruments TW100F-4  
Vertical glass puller   Narishige PC-10  
Petroff-Hausser counting chamber   Hausser scientific 3900  
Microloader pipette tips   Eppendorf 930001007  
Femtojet microinjector   Eppendorf 920010504  
Foot control FemtJet   Eppendorf 920005098  
Phosphate buffered saline   Fisher Scientific BP665-1 Filter-sterilized

Referenzen

  1. Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
  2. Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T., Samuels, D. S., Radolf, J. D. . Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. , 353-405 (2010).
  3. Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
  4. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
  5. Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
  6. Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
  7. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
  8. Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
  9. Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent’s successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
  10. Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
  11. Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
  12. Fuente, d. e. l. a., Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
check_url/de/2544?article_type=t

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544, doi:10.3791/2544 (2011).

View Video