Methoden voor snelle overdracht en localisatie van Lyme pathogenen in de Tick Gut
Summary
De ziekte van Lyme studies vereisen vaak generatie van de teken besmet met de ziekteverwekker Borrelia burgdorferi, een proces dat normaal gesproken duurt enkele weken. Hier laten we zien een micro-injectie-based tick infectie procedure die kan worden bereikt binnen enkele uren. We tonen ook aan een immunofluorescentie methode voor het in situ lokalisatie van B. burgdorferi in teken.
Abstract
Ziekte van Lyme wordt veroorzaakt door infectie met de spirocheet ziekteverwekker Borrelia burgdorferi, die in de natuur onderhouden door een tick-knaagdier infectie cyclus 1. Een teek overgedragen murine model 2 is ontwikkeld om de ziekte van Lyme studie in het laboratorium. Terwijl de naïeve teken kunnen besmet worden met B. burgdorferi door ze te voeren op geïnfecteerde muizen, het rui proces duurt enkele weken tot maanden in beslag. Daarom is de ontwikkeling van meer snelle en efficiënte vink infectie technieken, zoals een micro-injectie-gebaseerde procedure, is een belangrijk instrument voor de studie van de ziekte van Lyme 3,4. De procedure vereist slechts uren voor het genereren van besmette teken en laat de controle over de levering van gelijke hoeveelheden van spirocheten in een cohort van teken. Dit is vooral belangrijk als de generatie van B. burgdorferi besmette teken door de natuurlijke voeding proces met behulp van muizen niet 100% besmettingsgraad en mogelijk resulteert in een variatie van een ziekteverwekker lasten te waarborgen onder gevoed teken. Daarnaast kunnen micro-injectie gebruikt worden om teken te infecteren met B. burgdorferi isolaten in gevallen waarin een verzwakte stam niet in staat is om infectie te vestigen in muizen en kan dus niet op natuurlijke wijze worden verkregen door teken 5. Deze techniek kan ook worden gebruikt om een verscheidenheid van andere biologische materialen te leveren in het teken, bijvoorbeeld specifieke antilichamen of dubbelstrengs RNA 6. In dit artikel zullen we de micro-injectie van nimfen teken te tonen in vitro gekweekte B. burgdorferi. We zullen ook beschrijven een methode voor het lokaliseren van de ziekte van Lyme pathogenen in de teek darm met behulp van confocale microscopie immunofluorescentie.
Protocol
Discussion
Hier laten we zien een micro-injectie op basis van de procedure voor een snelle en efficiënte infectie van nimfen Ixodes teken met de bacteriële ziekteverwekker B. burgdorferi. We beschrijven ook een confocale immunofluorescentie procedure voor de detectie van B. burgdorferi in de teek darm in situ. Hoewel onze demonstratie gaat nimfen gut, soortgelijke procedures zijn ook van toepassing voor de andere ontwikkelingsfasen van teken, zoals de larve of volwassenen 8,9. Echter, vanweg…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onze oprechte dank de leden van de Pal laboratorium voor hulp bij de voorbereiding van deze demonstratie. Dit onderzoek werd ondersteund door PHS beurzen AI076684 en AI080615 van NIH / NIAID.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | ||
| Vertical glass puller | Narishige | PC-10 | ||
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | ||
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | ||
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | ||
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | ||
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
Referenzen
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T., Samuels, D. S., Radolf, J. D. . Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. , 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent’s successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, d. e. l. a., Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
