שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק
Summary
ליים מחלות מחקר מחקרים לעיתים קרובות דורשים דור של קרציות נגוע הפתוגן Borrelia burgdorferi, תהליך זה לוקח בדרך כלל מספר שבועות. כאן אנו מדגימים microinjection מבוססי זיהום סמן הליך זה יכול להתבצע תוך שעות ספורות. אנחנו גם להדגים שיטה immunofluorescence עבור בלוקליזציה באתרו של B. burgdorferi בתוך קרציות.
Abstract
מחלת ליים נגרמת על ידי זיהום עם הפתוגן החיידק Borrelia burgdorferi, אשר נשמר בטבע על ידי מחזור קרציות מכרסם זיהום 1. מודל סמן נישאים Murine 2 פותחה ללמוד מחלת ליים במעבדה. בעוד קרציות נאיבי יכול להיות נגוע ב burgdorferi מאכילים אותם על עכברים נגועים, תהליך הנשירה לוקח מספר שבועות עד חודשים כדי להשלים. לכן, פיתוח מהיר ויעיל יותר זיהום טכניקות סמן, כגון הליך מבוסס microinjection-, הוא כלי חשוב לחקר מחלת ליים 3,4. ההליך דורש שעות רק כדי ליצור קרציות נגועות ומאפשר שליטה על אספקת כמויות שוות של שהחיידקים במדגם של קרציות. הדבר חשוב במיוחד כמו דור ב ' קרציות burgdorferi נגועים על ידי תהליך טבעי האכלה באמצעות עכברים נכשל כדי להבטיח שיעור זיהום 100% ואפשרות תוצאות וריאציה של הנטל בין הפתוגן קרציות נמאס. יתר על כן, microinjection ניתן להשתמש כדי להדביק קרציות עם B. burgdorferi מבודד במקרים בהם הלחץ נחלש אינו מסוגל להקים זיהום בעכברים ולכן לא ניתן לרכוש באופן טבעי על ידי קרציות 5. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לספק מגוון של חומרים ביולוגיים אחרים לתוך קרציות, למשל, נוגדנים ספציפיים או פעמיים תקועים RNA 6. במאמר זה נדגים את microinjection של קרציות nymphal עם במבחנה גדל ב burgdorferi. אנו גם מתארים שיטה לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים במעיים סמן באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence confocal.
Protocol
Discussion
כאן אנו להדגים הליך microinjection המבוסס על זיהום מהיר ויעיל של קרציות קרצית nymphal עם הפתוגן חיידקי B. burgdorferi. אנחנו גם לתאר הליך immunofluorescence confocal לצורך זיהוי של B. burgdorferi במעיים סמן באתרם. למרות ההפגנה שלנו כרוך בטן nymphal, נהלים דומים חלים גם על שלבי ההתפתחות השני של…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו מאוד מודים אנשי המעבדה פאל על הסיוע בהכנת ההפגנה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים PHS AI076684 ו AI080615 מ-NIH / NIAID.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | ||
| Vertical glass puller | Narishige | PC-10 | ||
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | ||
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | ||
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | ||
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | ||
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
Referenzen
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T., Samuels, D. S., Radolf, J. D. . Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. , 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent’s successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, d. e. l. a., Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
