Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

1. Transformação plasmídeo do Target cDNA Parte I: Transformação de Plasmid (Tempo necessário: 3 horas mais de incubação durante a noite) Caldo quente SOC nutrientes em um banho de água 42 ° C (500 mL por reação) Descongele as células competentes sobre o gelo Adicionar 1 mL a 25 mL plasmídeo células competentes Colocar no gelo por 20 minutos Calor células de choque em 42 banho de água ° C por 45 segundos Colocar imediatamente as células no gelo por 2 minutos Adicionar 500 mL de 42 ° C caldo de nutrientes para cada frasco de células Agite a 37 ° C por 2 horas a 255 rotações por minuto (rpm) Placa 75 mL mix de transformação em Luria Bertani placas (LB) ágar Incubar as placas invertidas a 37 ° C durante a noite Parte II: E. Cultura coli (Tempo necessário: 15 minutos acrescido de incubação durante a noite) Para cada reação, 3 alíquota caldo LB mL e 3 mL de 50 mg / mL ampicilina em um tubo de cultura Raspe uma colônia de bactérias da placa de agar e adicionar a cada tubo de cultura Agitar tubos de cultura a 37 ° C em 255 rpm durante a noite Parte III: Prep Plasmid (Tempo necessário: 1,5 horas) Isolar plasmídeo de culturas durante a noite usando o Kit 5 Mini Prime FastPlasmid (Catalog # 2300000) Para verificar a presença de plasmídeo preparada, execute o DNA eluído do kit em um gel de 1% Tris-acetato-EDTA (TAE) corado com brometo de etídio 2. In Situ DIG marcado Síntese da sonda RNA Parte I: Linearização de Plasmid (Tempo necessário: 2,5 horas) Em um microtubo de 1,5 mL, combine: Preparado Plasmid 20 mL * Enzima de restrição 2 mL Tampão ** 10 mL 10X albumina bovina (BSA) 10 mL Dietil Pyrocarbonate Água (DEPC) 58 mL 100 mL Incubar a 37 ° C por 2 horas * Varia de acordo com plasmídeo ** Varia de acordo com enzima de restrição Parte II: Transcrição (Tempo necessário: 3 horas) Em um microtubo de 1,5 mL, combine: Linear Plasmid 4 mL Tampão Transcrição 10X ** 4 mL Digoxigenina Mix Etiqueta 4 mL * Polimerase 2 mL Inibidor de RNase 2 mL Água DEPC 24 mL 40 mL Incubar a 37 ° C por 1 hora Adicione 2 mL da polimerase * Incubar a 37 ° C por 1 hora Adicione 2 mL de DNase Incubar a 37 ° C por 20 minutos * Varia de acordo com plasmídeo ** Varia de acordo com polimerase Parte III: Precipitação (Tempo necessário: 5 minutos mais duas horas de incubação durante a noite, uma hora para outra centrífuga e re-suspensão) Adicionar 4 mL de EDTA 0,2 M Adicionar 5 mL de cloreto de lítio 4M Adicionar 150 mL de etanol 100% gelado Incubar a -80 ° C por 2 horas durante a noite Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, embora decante o sobrenadante Pellet seco por 7 minutos Re-suspender em 20 mL de água DEPC Incubar a 37 ° C por 5 minutos Parte IV: Fracionamento – Executar apenas se o tamanho da sonda é superior a 0,6 kb (Tempo necessário: Varia com base no tamanho da sonda, geralmente não mais de 20 minutos) Em um microtubo de 1,5 mL, combine: RNA Probe 20 mL Água DEPC 12 mL Bicarbonato de sódio 4 mL Carbonato de Sódio 4 mL 40 mL Incubar em banho-maria a 60 ° C. O tempo de incubação de base na seguinte equação: Tempo (min.) = (partida kb – desejado kb) / (0,11 x de partida kb x desejado kb) Tamanho desejado média = 0,6 kb Parte V: Precipitação final (Tempo necessário: 5 minutes mais duas horas de incubação durante a noite, uma hora para outra centrífuga e re-suspender, 1 hora para eletroforese em gel) Adicionar 40 mL de água DEPC Adicionar 8 mL de acetato de sódio Adicionar 1,04 mL de ácido acético glacial Adicionar 240 mL de gelo etanol frio a 100% Incubar a -80 ° C por 2 horas durante a noite Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, embora decante o sobrenadante Pellet seco por 7 minutos Re-suspender em 20 mL de água DEPC Vortex para misturar Para verificar a presença de riboprobe, executar a solução re-suspensas em um gel corado 1% TAE com brometo de etídio 3. Monte todo Hibridização In Situ Parte I: A fixação de embriões e proteinase K Digestão (Tempo necessário: Fix horas durante a noite, mais 4 no dia seguinte para o armazenamento, 2,5 horas de armazenamento com a Parte II) Coletar embriões encenado zebrafish e corrigir em paraformaldeído 4% (PFA) durante a noite a 4 ° C Lavar embriões fixados em tampão fosfato salina contendo 0,1% Tween-20 (PBST) 3 vezes por 10 minutos cada Para garantir a exposição dos embriões aos reagentes experimental, embriões dechorionate manualmente (se necessário) usando uma pinça de ponta fina Desidratar embriões por lavagem em uma série graduada de 25% e metanol 50% em PBST por uma hora cada lavagem, em seguida, armazenar em metanol 100% a -20 ° C Quando estiver pronto para uso, reidratar embriões em PBST por lavagem em 50% (2 vezes) e 25% (1 vez) de metanol em PBST por 10 minutos cada. Finalmente, lavar 2 vezes durante 10 minutos cada, em PBST 100%. Momento exato não é importante para PBST / metanol lava Bleach embriões em uma solução de peróxido de hidrogênio 10% em PBST, se necessário, para remover os pigmentos escuros. Embriões devem incubar em solução de peróxido de hidrogênio por 10-20 minutos, dependendo da idade do embrião, ea tampa do tubo de microcentrífuga deve permanecer aberta para evitar acumulação de pressão de ar Embriões Digest com 50 mg / mL de Proteinase K diluído 1:5000 em PBST de 15/03 minutos, dependendo da idade do embrião Re fix-embriões em PFA 4% por 30 minutos, e depois lave 3 vezes em PBST por 5 minutos cada Parte II: A hibridação de Riboprobes (Tempo necessário: 3 horas mais durante a noite para hibridação, 1,5 horas no dia seguinte com a Parte III) Prehybridize embriões com solução prehybridization (PHS), em pré-aquecido a 70 · Banho de água C por 2-3 horas Remover PHS, adicionar 0,5 mL de solução de hibridização e 1,5 mL previamente sintetizado digoxigenina riboprobes rotulados, incubar a 70 ° C durante a noite. Temperatura poderá variar dentro de alguns graus, dependendo do alvo riboprobe No dia seguinte, lave embriões a 70 ° C em soluções graduais de 75%, 50% e 25% PHS em citrato de sódio, solução salina 2X (SSC) por 10 minutos cada, em seguida, lave em 0,2 X SSC por 30 minutos a 68 ° C Lavar em tampão de ácido maleico (MAB) 2 vezes por 10 minutos cada em temperatura ambiente Parte III: Anti-digoxigenina (DIG-α) Incubação de anticorpos (Tempo necessário: 3 horas mais durante a noite para bloco, 2,5 horas no dia seguinte com a Parte IV) Transferência de embriões para uma placa de 12 poços Bloco pré-embriões em solução mL 1-2 bloqueio por pelo menos 3 horas à temperatura ambiente Ao mesmo tempo, pré-bloco do anticorpo preparando um segundo volume de solução de bloqueio e diluindo o anticorpo anti-digoxigenina 1:2000 nesta solução Remover pré-bloco e adicionar 1-2 mL de pré-bloqueados solução α-DIG, incubar overnight a 4 ° C No dia seguinte, lave embriões no MAB. Permitir que os embriões para incubar no MAB por 5 minutos em primeiro lugar, em seguida, executar alterações no buffer e incubar por dois minutos 10, uma 30 minutos e um intervalo de 60 minutos. Momento exato não é necessário Lavar embriões 3 vezes por 5 minutos cada em tampão Fosfatase Alcalina (AP) Parte IV: Coloração e Processamento Final (Tempo necessário: uma hora durante a noite para a coloração, dependendo da riboprobe usado, quatro horas para o início de lavagens glicerol, 10/06 horas por lavagem de glicerol, podem ser armazenados em glicerol) Adicione 1-2 mL de solução de coloração para os embriões, embrulhe a placa em papel alumínio, e verificar a coloração em intervalos regulares (a cada 20 minutos) até que a coloração é suficiente Lavar embriões com PBST 2 vezes por 5 minutos cada um para parar a reação de coloração Desidratar embriões usando 10 lavagens minutos em 25% (1 vez) e 50% (2 vezes) metanol em PBST, em seguida, em metanol 100%, para remover a coloração de fundo Permitir que embriões para incubar em metanol 100% por pelo menos duas horas em temperatura ambiente Reidratar em PBST com 10 lavagens minutos em 50% (2 vezes) e 25% (1 vez) de metanol em PBST, em seguida, lave em 100% PBST 2 vezes Transferência e manchadambryos a uma solução de glicerol 80% em PBST, usando uma série graduada de lavagens, e armazenar a 4 ° C. Receitas: Placas-10 LB agar agar LB g + 250 mL de água destilada, autoclave, quando fria ao toque juntar 250 mL ampicilina, despeje solução mL 15-20 quente em cada placa de Petri, permitem ágar para solidificar Caldo-12.5 LB caldo LB g + 200 mL de água destilada, autoclave, deixe esfriar antes de usar 1% TAE gel-agarose 0,4 g, 40 mL TAE 1X, 2 mL de brometo de etídio; carga 7 (Transformação Plasmid do Target cDNA) plasmídeo mL ou 3 mL riboprobe e 4 mL de água DEPC (In situ DIG marcado Síntese Probe RNA) + um corante de carregamento mL, 5 mL escada de DNA Formamida Prehybridization solução de 50%, SSC 5X, 9.2mm ácido cítrico, 1% Tween-20 Solução de hibridização solução prehybridization-plus 500 mcg / mL tRNA e 50 mcg / mL de heparina MAB-100mM ácido maleico, 150mm NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% Tween-20, pH para 7,5 Bloqueando-Solução 3 partes MAB, 1 parte de 10% de reagente Boehringer bloqueio no MAB, uma parte do calor desativado cordeiro soro AP-buffer 60mm pH Tris-HCl a 9,5, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0,1% Tween-20 Solução-5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato de coloração (BCIP) e Nitro blue tetrazolium (NBT) em tampão AP 4. RESULTADOS REPRESENTANTE Quando realizada corretamente, a reação entre o NBT, BCIP, e fosfatase alcalina formará um precipitado roxo que deve aparecer no embrião do zebrafish como uma mancha roxa. Riboprobes deve ser previamente sintetizado a partir do cDNA correspondente ao gene de interesse. Portanto, pode-se concluir qualquer visualizadas mancha representa áreas do paulistinha em que o gene de interesse foi transcrita nessa fase especial de desenvolvimento. Para os fins deste curso, riboprobes foram sintetizados a partir aldh1a2 (anteriormente raldh2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates et al, 2005.); myod1 (Weinberg et al, 1996.); shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) e myl7 (anteriormente cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Coloração era esperado na linha média e em estruturas anatômicas, incluindo os somitos, tailbud, myotome, cérebro e coração. Mutantes Ace/fgf8a Esperava-se que têm defeitos em muitas destas estruturas. Coloração foi facilmente visualizado através de um microscópio padrão de dissecação. Fontes adicionais contêm mais informações e solução de problemas em WISH técnicas semelhantes às descritas aqui (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). Figura 1. Um embrião zebrafish 24 horas após a fecundação, que tem sido hibridizado com riboprobes específicas para aldh1a2. Coloração específica pode ser visto nos olhos, cérebro posterior, peitoral fin bud primórdios, e somitos. Anterior é para o topo, é posterior ao fundo. Figura 2. Um embrião zebrafish na fase somito 13 de desenvolvimento que tem sido hibridizado com uma sonda específica para fgf8a. Coloração específica é visto no telencéfalo, diencéfalo dorsal, mesencéfalo rombencéfalo-limite, somitos, e tailbud. Ventral é para a esquerda, dorsal é para a direita. Figura 3. A 22 horas após a fecundação do embrião zebrafish que foi hibridizada com uma específica para riboprobe pax2a, um marcador robusto útil para visualizar o sistema nervoso. Coloração específica pode ser visto na fissura coróide, mesencéfalo rombencéfalo-limite, vesícula ótica, e os neurônios da medula espinhal. Vista dorsal, com anterior para a esquerda.