Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

1. Trasformazione plasmide di Target cDNA Parte I: Trasformazione di plasmidi (Tempo richiesto: 3 ore più notte di incubazione) SOC caldo brodo di coltura in un bagno d'acqua ° 42 C (500 microlitri per reazione) Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio Aggiungere 1 ml plasmide a 25 microlitri cellule competenti Mettere in ghiaccio per 20 minuti Scossa cellule bagno di calore in 42 ° C acqua per 45 secondi Immediatamente posto le cellule in ghiaccio per 2 minuti Aggiungere 500 ml di 42 ° C brodo di coltura di ogni flaconcino di cellule Agitare a 37 ° C per 2 ore a 255 giri al minuto (rpm) Tavola 75 mix trasformazione microlitri su Luria Bertani (LB) piastre di agar Incubare le piastre invertita a 37 ° C per una notte Parte II: E. coli Cultura (Tempo richiesto: 15 minuti più incubazione overnight) Per ogni reazione, aliquota 3 ml di brodo LB e 3 ml di 50 mg / ml di ampicillina in un tubo di cultura Raschiare 1 colonia batteri dalla piastra di agar e aggiungere ad ogni provetta cultura Agitare provette di coltura a 37 ° C a 255 giri al minuto durante la notte Parte III: Prep plasmidi (Tempo richiesto: 1,5 ore) Isolare plasmide di culture durante la notte con il 5 Kit Primo Mini FastPlasmid (Catalogo # 2300000) Per verificare la presenza del plasmide preparato, eseguire il DNA eluito dal kit su un 1% di Tris-Acetato-EDTA (TAE) gel colorato con bromuro di etidio 2. In Situ DIG marcato Sintesi RNA sonda Parte I: Linearizzazione di plasmidi (Tempo richiesto: 2,5 ore) In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: Preparato plasmidi 20 ml Enzima di restrizione * 2 ml Buffer ** 10 mL 10X sieroalbumina bovina (BSA) 10 mL Dietil pirocarbonato (DEPC) Acqua 58 ml 100 ml Incubare a 37 ° C per 2 ore * Varia con plasmide ** Varia con l'enzima di restrizione Parte II: Trascrizione (Tempo richiesto: 3 ore) In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: Lineare plasmidi 4 mL Trascrizione Buffer 10X ** 4 mL Digossigenina Etichetta Mix 4 mL Polimerasi * 2 ml RNasi inibitore 2 ml DEPC acqua 24 ml 40 ml Incubare a 37 ° C per 1 ora Aggiungere 2 ml di * polimerasi Incubare a 37 ° C per 1 ora Aggiungere 2 ml di DNasi Incubare a 37 ° C per 20 minuti * Varia con plasmide ** Varia con la polimerasi Parte III: Precipitazioni (Tempo richiesto: 5 minuti più 2 ore per notte di incubazione, 1 ora di centrifugare e risospendere) Aggiungere 4 ml di EDTA 0,2 M Aggiungere 5 ml di cloruro di litio 4M Aggiungere 150 ml di etanolo freddo ghiaccio al 100% Incubare a -80 ° C per 2 ore a notte Centrifugare a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, lontano decantare il surnatante Pellet secco per 7 minuti Risospendere in 20 microlitri di acqua DEPC Incubare a 37 ° C per 5 minuti Parte IV: Frazionamento – Eseguire solo se la dimensione della sonda è maggiore di 0,6 kb (Tempo richiesto: Varia in base alle dimensioni della sonda, di solito non più di 20 minuti) In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: RNA sonda 20 ml DEPC acqua 12 ml Sodio Bicarbonato 4 mL Carbonato di sodio 4 mL 40 ml Incubare in un bagno d'acqua a 60 ° C. Base il tempo di incubazione sull'equazione: Tempo (min.) = (a partire kb – voluta kb) / (0,11 x a partire kb x desiderato kb) Media dimensione desiderata = 0,6 kb Parte V: Precipitazioni finale (Tempo richiesto: 5 minsce più 2 ore per notte di incubazione, 1 ora di centrifugare e ri-sospendere, 1 ora per elettroforesi su gel) Aggiungere 40 microlitri di acqua DEPC Aggiungere 8 microlitri di sodio acetato Aggiungi 1,04 microlitri di acido acetico glaciale Aggiungere 240 microlitri etanolo freddo ghiaccio al 100% Incubare a -80 ° C per 2 ore a notte Centrifugare a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, lontano decantare il surnatante Pellet secco per 7 minuti Risospendere in 20 microlitri di acqua DEPC Vortex per miscelare Per verificare la presenza di riboprobe, eseguire il risospese in una soluzione 1% gel colorato TAE con bromuro di etidio 3. Montare tutto ibridazione in situ Parte I: Fissazione di embrioni e di digestione proteinasi K (Tempo richiesto: Fix più 4 ore durante la notte il giorno dopo per la conservazione, 2,5 ore da storage a parte II) Raccogliere in scena embrioni di zebrafish e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) notte a 4 ° C Lavare gli embrioni fissato in tampone fosfato contenente 0,1% di Tween-20 (PBST) 3 volte per 10 minuti ciascuno Per garantire l'esposizione degli embrioni ai reagenti sperimentale, gli embrioni dechorionate manualmente (se necessario) con pinze a punta fine Disidratare embrioni con il lavaggio in una serie graduata di 25% e 50% di metanolo in PBST per un'ora ogni lavaggio, quindi memorizzare in 100% di metanolo a -20 ° C Quando si è pronti ad utilizzare, reidratare gli embrioni in PBST con il lavaggio a 50% (2 volte) e il 25% (1 volta) metanolo in PBST per 10 minuti ciascuno. Infine lavare 2 volte per 10 minuti ciascuno in 100% PBST. Data esatta non è importante per PBST / metanolo lava Embrioni candeggina in una soluzione di perossido di idrogeno al 10% in PBST, se necessario, per rimuovere i pigmenti scuri. Gli embrioni devono incubare in una soluzione di perossido di idrogeno per 10-20 minuti, a seconda dell'età dell'embrione, e il tappo della provetta da microcentrifuga deve rimanere aperta per evitare l'accumulo di pressione dell'aria Embrioni digerire con 50 mg / ml proteinasi K diluito 1:5000 in PBST per 3-15 minuti, a seconda dell'età degli embrioni Ri-fix embrioni in PFA 4% per 30 minuti, e poi lavare 3 volte in PBST per 5 minuti ciascuno Parte II: ibridazione di Riboprobes (Tempo richiesto: 3 ore in più durante la notte per l'ibridazione, 1,5 ore il giorno successivo alla Parte III) Prehybridize embrioni con la soluzione prehybridization (PHS), in un caldo 70 ° C acqua bagno per 2-3 ore Rimuovere PHS, aggiungere 0,5 mL soluzione di ibridazione e di 1,5 microlitri precedentemente sintetizzato riboprobes digossigenina marcato, incubare a 70 ° C durante la notte. La temperatura può oscillare all'interno di pochi gradi a seconda del bersaglio riboprobe Il giorno dopo, lavare gli embrioni a 70 ° C in soluzioni graduali di 75%, 50% e 25% PHS di 2X citrato di soluzione fisiologica di sodio (SSC) per 10 minuti ciascuno, quindi lavare in SSC 0.2X per 30 minuti a 68 ° C Lavare in tampone di acido maleico (MAB) 2 volte per 10 minuti a temperatura ambiente Parte III: Anti-digossigenina (α-DIG) Incubazione Anticorpo (Tempo richiesto: 3 ore in più durante la notte per bloccare, 2,5 ore il giorno successivo alla Parte IV) Trasferimento degli embrioni a una piastra 12 pozzetti Pre-embrioni in blocco 1-2 mL di soluzione di blocco per almeno 3 ore a temperatura ambiente Allo stesso tempo, pre-blocco l'anticorpo preparando un secondo volume di soluzione di saturazione e diluendo il anticorpo anti-digossigenina 1:2000 in questa soluzione Rimuovere pre-blocco e aggiungere 1-2 ml di pre-bloccato α-DIG soluzione, incubare una notte a 4 ° C Il giorno dopo, lavare gli embrioni in MAB. Lasciare gli embrioni ad incubare in MAB per 5 minuti prima, quindi eseguire modifiche del buffer e incubare per due di 10 minuti, uno di 30 minuti e un intervallo di 60 minuti. Data esatta non è necessaria Lavare embrioni 3 volte per 5 minuti ciascuno in fosfatasi alcalina (AP) tampone Parte IV: La colorazione e trattamento finale (Tempo richiesto: 1 ora a notte per la colorazione, a seconda della riboprobe usato, 4 ore all'inizio della lava glicerolo, 6-10 ore per lavare glicerolo, possono essere conservati in glicerolo) Aggiungere 1-2 mL di soluzione colorante per gli embrioni, avvolgere la piastra in alluminio, colorazione e controllare a intervalli regolari (ogni 20 minuti circa) fino a colorazione è sufficiente Lavare gli embrioni con PBST 2 volte per 5 minuti ciascuno per fermare la reazione di colorazione Disidratare embrioni utilizzando 10 lavaggi minuti nel 25% (1 volta) e il 50% (2 volte) metanolo in PBST, poi in 100% di metanolo, per eliminare la colorazione di fondo Lasciare embrioni ad incubare in 100% di metanolo per almeno 2 ore a temperatura ambiente Reidratare in PBST con 10 lavaggi minuti nel 50% (2 volte) e il 25% (1 volta) metanolo in PBST, quindi lavare in 100% PBST 2 volte Trasferimento e coloratimbryos ad una soluzione di glicerolo 80% in PBST, utilizzando una serie graduata di lava, e conservare a 4 ° C. Ricette: Piastre di agar-10 LB agar LB g + 250 ml di acqua distillata, autoclave, quando fredde al tatto si aggiungano 250 microlitri ampicillina, versare 15-20 mL di soluzione calda in ogni scatola di Petri, permettono agar per solidificare LB brodo-12.5 g brodo LB + 200 ml di acqua distillata, autoclave, lasciare raffreddare prima dell'uso 1% TAE-gel 0.4 g di agarosio, 40 ml 1X TAE, 2 bromuro di etidio microlitri; carico 7 microlitri plasmide (plasmidi Trasformazione di Target cDNA) o 3 riboprobe microlitri di acqua e 4 microlitri DEPC (in situ DIG marcato Sintesi RNA Probe) + 1 tintura microlitri di carico, 5 scaletta del DNA microlitri Prehybridization soluzione-50% formammide, SSC 5X, 9.2mm acido citrico, 1% Tween-20 Ibridazione soluzione prehybridization soluzione più 500 mg / ml tRNA e 50 mg / mL di eparina MAB-100mm acido maleico, 150mm NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% Tween-20, il pH a 7,5 Blocco Soluzione-3 parti MAB, 1 parte di reagente al 10% Boehringer blocco in MAB, 1 parte di calore disattivato agnello siero AP buffer-60mm Tris-HCl pH 9.5, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0.1% Tween-20 Soluzione-5-Bromo-4-cloro-3-fosfato indolil colorazione (BCIP) e Nitro blu di tetrazolio (NBT) in tampone AP 4. RAPPRESENTANTE RISULTATI Quando eseguito correttamente, la reazione tra l'NBT, BCIP, e fosfatasi alcalina si formerà un precipitato viola che dovrebbe apparire sul pesce zebra embrione come una macchia viola. Riboprobes deve essere preventivamente sintetizzato da cDNA corrispondente al gene di interesse. Pertanto, si può concludere qualsiasi visualizzati macchia rappresenta le aree del pesce zebra in cui il gene di interesse è stato trascritto in quella fase particolare dello sviluppo. Ai fini di questo corso, sono stati sintetizzati da riboprobes aldh1a2 (precedentemente raldh2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates et al, 2005.) myod1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) e myl7 (precedentemente cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. La colorazione era atteso sulla linea mediana e in strutture anatomiche tra cui il somiti, tailbud, myotome, cervello e cuore. Mutanti Ace/fgf8a ci si aspettava di avere difetti di molte di queste strutture. La colorazione era facilmente visualizzati utilizzando un microscopio standard di dissezione. Ulteriori fonti contengono maggiori informazioni e suggerimenti su Wish tecniche simili a quelle descritte qui (Clark, 2003;. Costa D'et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). Figura 1. Un embrione di zebrafish 24 ore dopo la fecondazione, che è stata ibridata con riboprobes specifici per aldh1a2. Colorazione specifica può essere vista negli occhi, romboencefalo, pinne pettorali gemma primordi, e somiti. Anteriore è al top, posteriore è al fondo. Figura 2. Un embrione di zebrafish allo stadio di 13 somiti di sviluppo che è stato ibridato con una sonda specifica per fgf8a. Colorazione specifica è visto nel telencefalo, diencefalo dorsale, mesencefalo-rombencefalo confine, somiti e tailbud. È ventrale a sinistra, dorsale è a destra. Figura 3. Un post 22 ore embrione fecondazione zebrafish che è stato ibridato con una specifica riboprobe per pax2a, un marker utile per la visualizzazione robusto il sistema nervoso. Colorazione specifica può essere visto nella fessura coroide, mesencefalo-rombencefalo confine, vescicola dell'orecchio, e neuroni del midollo spinale. Con vista dorsale anteriore a sinistra.