Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Mezo kristalizasyon deneyde bir tipik bir anahat, Şekil 1'de 1,2 gösterilmiştir . Ön kristalleşme LCP sıkı bağlamak deneyleri isteğe bağlıdır, ancak, önemli ölçüde, özellikle zor zarı proteinleri 3 durumda, ilk kristalizasyon koşulları için arama sürecini hızlandırabilir . 1. LCP içinde Protein Sulandırma Bir deterjan solüsyona ilgi bir membran proteini arındırmak ve konsantre ~ 10 protein / deterjan kompleksleri – 20 mg / ml, aşırı-konsantre deterjan 1,4 bakım alarak. Transfer ~ 25 mg bir LCP ana lipid (genellikle monoolein) veya 40 1.5 ml plastik tüp ve inkübe bir lipid karışımı ° C'de birkaç dakika lipid eriyene kadar. 100 mcL gaz sıkı şırınga için bir şırınga coupler takın. Ayarlanabilir bir hacimde pipet kullanarak erimiş lipid şırınga yükleyin. Şırınga içinde lipid hacmi kaydedin. Bir protein çözüm-lipid oranı 2 / 3 v / protein solüsyonu ile başka bir 100 mcL şırınga Yük v. Birlikte her iki şırınga şırınga coupler üzerinden bağlayın. Şırınga, lipid mesophase homojen hale gelinceye kadar, ileri ve geri Kuplörün iç iğne ile lipid ve protein hareket dönüşümlü olarak pistonları itin. LCP mekanik karıştırma üzerine kendiliğinden formları ve protein LCP, çift katlı lipid sulandırılmış olur. LCP oluşumu, küçük açılı X-ışını kırınımı 1 ile çapraz polarize ile donatılmış bir mikroskop altında bakıldığında, eğer mümkünse, saydam ve jel gibi bir tutarlılık ve birefringency yokluğunda tarafından doğrulanmış, ya da olabilir. 2. LCP-sıkı bağlamak Ön kristalleşme Tahliller LCP-sıkı bağlamak testlerin tarama koşulları 3 çeşitli LCP sulandırılmış membran proteinlerinin difüzyon özelliklerini ölçmek için tasarlanmıştır. LCP zarı proteinleri uzun menzilli difüzyon başarılı kristalizasyon için gerekli, ancak LCP mikro büyük proteinler veya oligomerik protein agrega difüzyon kısıtlar. Mezo kristalizasyon deneyi bir başarısızlığı için ortak bir nedeni difüzyon kaybına yol açan hızlı bir protein agregasyonu. Bir protein toplama davranışı özellikle protein yapı, ev sahibi lipid ve tarama çözümü 3 bileşimi bağlı olduğu görülmüştür. Etiket, proteinin floresan boya ile (Cy3 veya benzeri) bir protein / boya ~ 100 / 1 oranında girmemiş boya kaldırmak ve ~ 1 mg / ml protein konsantresi. Etiket ya serbest aminler veya ücretsiz tiyoller. Ücretsiz aminler etiketleme, ağırlıklı olarak serbest N-terminalindeki etiket, 7 ve 7.5 arasında pH kullanın. Amino etiketleme lipidler co-saflaştırılmış protein 2,3 ile etiket farkında olun. Sulandırın 1. bölümde açıklandığı gibi LCP etiketli protein). Tahlil plakalar yerine kristalizasyon ekranlarında 2 LCP-sıkı bağlamak tarama çözümleri kullanarak) 3. bölümünde açıklandığı gibi ayarlayın. 20 plakalar inkübe ° C denge durumuna ulaşmak için en az 12 saat süreyle karanlıkta. 10x objektif kullanarak ilk LCP sıkı bağlamak istasyonu ve odak yerleştirin plakalar. Ilk ön-ağartılmış durumunu yakalamak için 5 floresan görüntüler elde. Lazer tetikler. Ağartılmış spot ortasında etiketli protein% 70 – çamaşır suyu ~ 30 bakliyat lazer gücü ve sayısı ayarlanabilir olmalıdır. Lazer tetikleme hemen sonra, mümkün olan en hızlı hızı ~ 200 resimler hızlı bir post-beyazlatma dizisi kaydetmeye başlamak. Protein difüzyon hızı bağlı olarak 1-20 sn gibi görüntüler arasında gecikme seçerek ~ 50 resimler, yavaş bir post-çamaşır suyu dizisi kaydı ile izleyin. Tüm çerçeveler içinde çamaşır suyu nokta yoğunluğu içinde entegre ve lazer ağartılmış alanının dışında bir referans nokta ortalama yoğunluğu, ağartılmış nokta içinde yoğunluğu bölerek satın alma sırasında yoğunluk dalgalanmaları ağartma ve ışık için doğru. 1'e eşit önceden ağartılmış yoğunluğu ve ilk ağartılmış yoğunluğu 0'a eşit yapmak için düzeltilmiş yoğunluk Normale. Aşağıdaki denklem 5 kullanılarak normalize yoğunluğu vs zaman, F (t) eğrisi Fit: F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + 1 (2T / t)), (Eq.1) M difüzyon moleküllerin cep fraksiyonu, T karakteristik difüzyon süresi mi, 0 kaydedilen her karenin gerçek zamanlı ve ben 1 0. ve 1. sırası Modifiye Bessel fonksiyonları. Difüzyon katsayısı, D gibi hesaplayın: D = R 2 / 4T (Eq.2) R ağartılmış spot yarıçapı. T Taşıo 2.13) yanında iyi ve adımları tekrarlayın 2.5). Farklı tarama koşulları için elde edilen mobil kesirler ve difüzyon katsayıları karşılaştırın. Tasarım yeni kristalizasyon protein difüzyon ve protein difüzyon görülmedi hangi hariç koşulları kolaylaştırılmış bileşenleri dayalı ekranlar. Protein ekranlı durumlardan herhangi diffüz olmadıysa, tarama alanı genişletilmesi veya yeni bir protein inşa çalışıyor düşünün. 3. LCP Kristalizasyon Denemeler Ayarlama LCP içinde sulandırın protein gibi) 1 bölümünde açıklanan. Protein yüklü LCP tekrarlayan bir şırınga dağıtıcı bağlı bir gaz sızdırmaz 10 mcL şırınga içine aktarın. 10 mcL şırınga, kısa bir çıkarılabilir iğne (gösterge 26, 10 mm uzunluk) takın. 2×2 bir kare oluşturan bitişik dört kuyu yüzeyinde LCP 200 nL bolus koyun. 1 mcL ilgili kristalizasyon ekran çözümü ile her LCP bolus Overlay. Cap dört bir 18 mm kare cam lamel yüklü kuyu. Kuyu mühür lamel üzerine nazik bir basınç uygulayın. 4 kuyu sonraki bütün plaka dolana kadar) 3.4) -3,6 adımları tekrarlayın. Kristal oluşumu ve büyümesi için periyodik olarak kontrol, tabak sabit bir sıcaklıkta inkübe edin. 4. LCP gelen Kristaller Hasat Doğrusal bir döner polarize ve analiz ile donatılmış bir stereo mikroskop altında değişken zoom ile protein kristalleri ile bir tabak koyun. Bütün iyi görüş alanı içinde yer almakta olup, böylece düşük güç zoom kullanırken ilgi iyi odaklanın. Keskin bir köşe, seramik kılcal kesme taş kullanılarak iyi sınırları içinde bir kare dört vuruş lamel cam Puan. Lamel cam kalınlığı boyunca çizikler yaymak için güçlü keskin nokta cımbız ile gol çevresinde basın. Punch iki küçük delik attı kare ters köşe. Yağışlı çözüm birkaç mcL sonraki adımları sırasında dehidrasyon azaltmak için bir delik aracılığıyla enjekte edilir. Açılı keskin bir iğne probu kullanarak cut-out kare serbest bırakmak için bir ya da iki tarafı boyunca cam kırmak. Kübik faz bolus cam kare izlenme dikkatlice yukarı doğru kaldırın. Bolus lamel sıkışmış ise, o kuyunun altındaki kare yer ve cam üzerine çevirin. Yağışlı bir çözüm ekstra birkaç mcL ile desteklenmiş bir cryo-Koruyucu, gerekirse, kuyu maruz küp faz bolus üstüne. Mikroskop büyütme artırın ve bir kristal odaklanmak. Hasat döngüsü görmek için yeterli ışık tutarken, birefringent kristal ve arka plan arasındaki kontrastı arttırmak için polarize ve analizör arasındaki açıyı ayarlayın. MiTeGen MicroMount kristal boyutu ile eşleşen bir çapa sahip bir seçin ve sonra MicroMount içine scooping LCP doğrudan kristal hasat. Flash sıvı azot hasat kristal MicroMount dondurma, ve, X-ışını veri toplama 6 için sinkrotron kaynağı beamline gemi . 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bir mühendislik insan beta-2 adrenerjik G protein kenetli reseptör (β 2 AR-T4L) bakülovirüs sf9 böcek hücreleri enfekte dodecylmaltoside (DDM) / 7 carazolol kısmi bir ters agonisti bağlı kolesteril hemisuccinate (CHS) deterjan solüsyonu saflaştırılmış ifade edildi. Protein Cy3 NHS ester ile etiketlenir ve LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testleri (Şekil 2) kullanılmıştır. LCP-sıkı bağlamak testlerinin sonuçları seçilen çeşitli koşullar dayalı Kaba ızgara ekranları ilk kristal gibi vurur (Şekil 3). Yağışlı koşullarının daha fazla optimizasyon kırınım kalite kristalleri (Şekil 4) vermiştir. Şekil 1 tipik bir LCP kristalizasyon deneyi Akış şeması. Gri kutular Adımlar mevcut protokoller açıklanan değildir. Şekil 2 monoolein tabanlı LCP β 2 AR-T4L/carazolol LCP-sıkı bağlamak tahlil. A) LCP-sıkı bağlamak testinin sonuçları, 96 plaka her örnek sırayla ağartılmış ve 30 dakika inkübasyondan sonra floresan kurtarma ölçüldüğü, yüksek verimli otomatik modda. Her bir numune mobil bölümünü temsil edilen floresan kurtarma, 96 numuneler için çizilir. Tarama çözümleri iki farklı konsantrasyonda az 48 farklı tuzları ile birlikte 0,1 M Tris pH: 8,% 30 v / v PEG 400 içerir. B) birkaç temsilcisi Floresan kurtarma profilleriresentative koşulları. Düz çizgi eğrileri Denklem tarafından uyuyor temsil eder. 1. cep kesirler ve difüzyon katsayıları Denklem kullanılarak belirlenir. 1 ve 2. ,% 10 daha az Na klorür içeren örnek hızlı iyileşme co-saflaştırılmış protein ile floresan etiketli lipidler nedeniyle. Şekil 3 β 2 AR-T4L/carazolol ilk kristal hit LCP-sıkı bağlamak tarafından belirlenen en umut verici koşulları etrafında, sülfat Na içeren bir kaba ızgara tarama ile elde edilen (panel) ve Na biçimleri (panel). Protein Cy3 NHS ester ile etiketlenir ve 605 nm eksitasyon ve 543 nm dalga boyunda emisyon kullanarak floresan görüntüler alınır. Şekil 4. β 2 AR-T4L/carazolol Optimize edilmiş kristalleri. (Paneller A ve B), Na sülfat varlığı yetiştirilen kristalleri ve K biçimleri (panel C ve D) görüntüleri aydınlık modu (paneller A ve C) ve çapraz-polarize (paneller B ve D).