측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명

개요 : 프로토콜은 네 부분으로 나뉩니다. 파트 1은 먹이 박테리아를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 파트 2 웜 문화를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 3 부에서는 수명을 점수하는 방법에 대해 설명합니다. 4 부에서는 몇 가지 대표적인 결과를 보여줍니다, 그리고 제 5 부에 필요한 솔루션을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 수명 실험을 완료하는 데 몇 주가 걸릴. 프로토콜 주간의 각 단계에 대한, 일, 그리고 하루의 시간 계획을 용이하게하기 위해 포함됩니다. L4 단계 (데이 0) 전체 프로토콜에 대한 참조 포인트로 사용됩니다. 1. 수유 박테리아의 준비 이 섹션은 먹이 박테리아의 준비에 대해 설명합니다. 특정 E. 대장균은 OP50라고 C.elegans를 공급하는 데 사용되는 변형. 다른 박테리아와 웜 문화의 교차 오염을 방지하기 위해이 프로토콜을하기 전에, OP50 변형이 Carbenicillin / 암피실린 저항 21하였습니다. 사전에 OP50 4~5일를 준비합니다. OP50과 연락 오는 모든 자료는 멸균해야합니다. 일 -7 : 목요일 (주 1) : 접종 37 박 이상의 단일 OP50 식민지와 부화 ° 세균 통에 C 100 μg / ML 암피실린 및 0.1 μg / ML Amphotericin B를 포함하는 TB 5 ML. 일 -6 : 금요일 (주 1). 아침 8시 반. 문화 충분한 시간이 포화에 도달하도록 초기 접종 50 μg / ML 암피실린을 포함한 300 ML의 TB에서 OP50 1:2000의 야간 문화를 희석. 채도에 도달할 때까지 37 8~12시간에 대한 세균 쉐이크 ° C의 문화를 품다. 문화 14 시간 이상 성장을 허용하지 않습니다. 멸균, 사전에 가중치 원심 분리 관에 OP50을 전송합니다. 펠렛 테이블 톱 원심 분리기에서 3,500 RPM (2,200 XG) 10 분 원심 분리하여 OP50. 뜨는을 취소하고 멸균 물 속에 다시 중지 OP50 펠렛하고 다시 원심 분리하여 펠렛. 두번 세척을 반복합니다. 두 번째 세척 후, 모든 남아있는 물을 조심스럽게 제거합니다. 물도은 튜브에 남아되지 않을 것입니다. 펠렛을 포함하고있는 원심 분리 튜브를 저울질하고 펠렛의 무게를 결정하기 위해 비어있는 원심 분리 관의 무게를 뺍니다. 철저히 100 MG / ML의 농도 S – 완료의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 아무도 대단히 짧은 시간을 둘 수 없습니다. 100 MG / ML OP50의 농도는 2 X10 10 세균 / ML에 해당한다. ML 당 박테리아의 광학 밀도와 숫자 사이의 관계가 알려져있다면 ML 당 박테리아의 수를 결정하는 사​​진 분광계를 사용하십시오. 필요한 경우, 2 X10 10 세균 / ML에 OP50 먹이 솔루션의 농도를 조정합니다. 4 OP50solution를 저장 °가 웜 문화에 사용되는 C까지. 2. 동기 웜 문화의 준비 이 섹션은 웜 문화의 준비에 대해 설명합니다. 그 목표는 벌레의 시대 – 동기 인구를 생성하는 것입니다. 5 단계에서 표백제 치료 후 C.elegans와 연락 오는 모든 자료는 멸균해야합니다. 플레이트는 별도로 표시 ° C 않는 20 보관됩니다. 일 -6 : 금요일 (주 1), 오후 4 오후 : 새로운 접시에 동물을 전송 웜 인구의 대다수가 굶어 죽었을 L1의 애벌레로 구성되어있는 5-10일 오래된 NGM 판을 가져가라. 곧 알콜 램프를 통해 그것을 가열하여 금속 주걱을 소독. 그것은 식지. 굶주린 벌레가 들어있는 접시에서 한천 덩어리를 잘라 냉각 주걱을 사용합니다. OP50와 신선한 10cm NGM 판에 씨앗이 덩어리 몇 가지를 전송합니다. 약 품어. 웜 인구의 대부분 gravid 성인 구성되어 ° C까지 20 65시간. 그것이 gravid 성인으로 성장하기 위해 굶어 L1 동물을위한 소요 시간은 변형의 변형에 따라 다를 수 있습니다. 주 -3 : 월요일 (주 2) 오전 10:00 : 동기 인구를 설정 50-10 ML 멸균 물을 접시 그들을 세척하여 10cm 접시에서 벌레를 수집합니다. 15 ML 원뿔 관에 웜 / 물 솔루션을 전송합니다. 1,200 RPM (280 XG)에서 탁상 원심 분리기 2 분 centrifuging하여 벌레를 씻으십시오. 뜨는을 취소하고 10 ML 물을 추가합니다. 반복합니다. 뜨는 제거하고 신선한 표백 / NaOH 용액 (2.5 ML 가정용 표백제, 1 ML 10N NaOH, 6.5 ML H 2 O) 5 ML를 추가합니다. 벌레가 열려 휴식까지 RT에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 와동 모든 분하시기 바랍니다. 해부 현미경 반응의 진행 상황을 모니터링합니다. 즉시 모든 어른 디졸브로 반응을 무력화 M9 버퍼의 5 ML를 추가합니다. (2,500 RPM에서 2 분 centrifuging 10 ML M9 버퍼와 달걀 세 번 씻어1,100 XG). 한번와 계란을 씻어 10 ML 2,500 RPM (1,100 XG) 2 분 centrifuging하여 S – 완료되었습니다. 뜨는 제거를 추가, 10 ML S는 – 완전하고 신선한 50 ML 원뿔 관에 대한 해결책을 전송합니다. 40 ML의 최종 볼륨 S – 완성 30 ML을 추가합니다. 부드럽게 nutator 또는 이와 유사한 장치에 실온에서 하룻밤 튜브를 흔들. 일 -2 : 화요일 (주 2) 12:00 : 접시에 종자 동물 해부 현미경, 벌레가 밤 동안 부화 여부를 확인하십시오. 해부 범위를 사용하여 10 μL 방울의 벌레의 수를 계산하여 S – 완벽한 솔루션에 벌레의 농도를 결정합니다. 각 샘플에 대해 적어도 10 방울을 계산합니다. 80-100 웜 / S 완성에 ML의 농도에있는 벌레를 다시 일시 중지합니다. 0.1 μg / ML의 최종 농도 50 μg / ML과 Amphotericin B (재고 250 μg / ML)의 최종 농도 Carbenicillin을 (재고 100 MG / ML) 추가합니다. nutator 악수. 벌레의 큰 수량을 준비하면, 필터 캡과 함께 600 ML의 nunclon 플라스크를 사용합니다. 오후 2시 반 6 MG / ML (= 1.2 X10 9 세균 / ML)의 최종 농도 1 부에서 준비한 OP50를 추가합니다. OP50 4 ° C.로 돌아가기 96 잘 접시의 각 우물에 worm/OP50 솔루션을 120 μL을 전송합니다. 투명한 바닥과 96 잘 접시를 사용합니다. pipetting 동안 정지에있는 벌레를 유지 있는지 확인하십시오. 오염 및 증발을 방지하기 위해 테이프 실러를 사용하여 번호판을 밀봉합니다. 2 분 microtiter 접시 쉐이크에 접시를 흔들 동물 L4 단계에 도달할 때까지 20 이일 ° C에 대해 숙고하다. 일 0 : 목요일 (주 2) 정오가 : Fluorodeoxyuridine을 추가하여 동물을 소독 (FUDR) 동물이 각각 잘 수있는 0.6 MM의 FUDR 주식 솔루션 30 μL를 추가 소독합니다. 이 단계는 150 μL 각 우물에 최종 볼륨을 제공 5 MG / ML (1×10 9 세균 / ML)에 6mg / ML에서 OP50의 최종 농도를 감소시킵니다. 테이프 실러스를 사용하여 번호판을 봉인하고 microtiter 접시 쉐이크에서 2-3 분 흔들어. OP50이 일 -2에서 2시 30 분에 추가되었습니다면, 그것은 FUDR은 정오 전에 추가하는 것이 중요합니다. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 1 일 : 금요일 (주 2) : 문화에 약물을 추가 오전 9함으로써 동물의 대부분 gravid 여러 계란 각을 포함해야합니다. 누구의 영향 수명에 원하는 농도에서 테스트하는 약물을 추가합니다. DMSO에 마약을 분해하는 경우 DMSO의 최종 농도는 0.6 %가 C.elegans 수명을 단축보다 DMSO의 농도 높은 같은 0.6 %를 초과해서는 안됩니다. 약물 이외 후, 테이프 실러와 접시를 봉인하고 microtiter 접시 쉐이크에서 2-3 분 흔들어. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 마약를 추가하면 때때로, 특히 물보다 용매의 다른을 사용하는 경우, 접시 당 몇몇 동물을 죽일 수 있습니다. 죽은 동물을 확인하는 거꾸로 현미경을 사용합니다. 일반적으로, 96 잘 접시 당 미만 10 죽은 동물이 있어야합니다. 20 ° C 배양기로 번호판을 반환합니다. 일 4 : 월요일 (주 3) : 변경 실러스 실러를 제거 문화를 입력 신선한 산소를 허용하려면, 일분 후에 접시를 봉인. microtiter 접시 쉐이크에 2-3분에 대한 번호판을 흔들어. 매주 한 번 반복합니다. 제 5 일 : 화요일 (주 3) : 기아를 방지하기 위해 새로운 OP50 추가 기아를 방지하기 위해 96 우물의 각 부분 1 준비했습니다 100 MG / ML OP50 솔루션의 5 μL를 추가합니다. 3. 수명의 점수. 이 섹션은 동물들이 죽을때까지 제 2의 동기 웜 인구의 생존을 감시하는 방법을 설명합니다. 96 잘 접시에있는 동물을 관찰하려면, 2X 또는 2.5x 목적으로 거꾸로 현미경을 사용합니다. 기록 생존 데이터를 일주일에 세 번, 월요일, 수요일, 금요일. 동물이 살아 있거나 죽어있는지를 확인하기 위해 움직임을 사용합니다. 강한 빛, 특히 푸른 불빛이 이동하는 동물을 유도. 분석에서 죽은 동물을 제거하지 마십시오. 때로는 움직이지 않았고 앞의 수가 죽은 결정 동물은 나중에 이동 할 수도 있습니다. 일 0에, 실험의 시작 부분에 각 우물에 벌레의 총 수를 계산합니다. 이 우물의 동물로 분석에서 이상의 18 동물을 포함 우물을 검열 충분 OP50이되지 않으며식이 제한의 효과를 보여줍니다. 동물 2 분 microtiter 접시 쉐이크에 96 접시를 잘 흔들어 이동하는 기회를 증가하기 위하여. 전에 계산. 각 계수 세션 기록 날짜 및 동물의 수가 어느살아있는 동물로 이동합니다. 액체의 운동은 단단한 미디어에보다 쉽게​​하고 강한 조명에 의해 유도된 수 있습니다. 높은 배율의 사용은 인두의 끝을 분들처럼 매우 미묘한 움직임을 탐지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 미묘한 움직임은 종종 아주 오래된 동물 관찰 유일한 운동입니다. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 모든 동물이 죽을 때까지 2~3일마다 2-4 단계를 반복합니다. 4. 대표 결과. 이 섹션에서는이 분석과 몇 가지 대표적인 결과에 의해 생성되는 수명 데이터의 기록을 유지하는 방법에 대한 예제를 보여줍니다. 그림 1A는이 분석하는 동안 수명 데이터를 기록하는 방법에 대한 예제를 보여줍니다. 엑셀 시트는 생존 각 우물에 인구를 추적하는 데 사용됩니다. 각 잘 들어 그것이 몇달이 좌표의, 스트레인, 마약, 약물의 농도와 일 0에 살아있는 동물의 총 개수는 (X0) 실험의 시작 부분에 기록됩니다. 기록 날짜뿐만 아니라 생활과 죽은 동물의 수를 세 번 각각 잘의 다양한 인구의 생존을 수행하기 위해 주. 그래프 결과를 위해, 매일 매일 살아있는 동물의 분율을 계산하고 일 시간의 함수로 플롯. P – 값은 스타타 또는 이와 유사한 소프트웨어와 같은 통계 패키지를 사용하여 계산해야합니다. C.elegans의 매체 수명은 온도에 따라 달라집니다. 그림 1B는 수명의 온도 종속 변경 사항이 정확하게 수명 분석 22 기반 microtiter에 의해 복제되는 보여줍니다. 마찬가지로, microtiter 플레이트 분석 야생 타입 N2 동물 23-24 25 (그림 1C)에서 다를 lifespans을보고 돌연변이에서 수명의 변화를 재현한. 분석은 또한 더 많은 양적 진술을하기 위해 사용할 수 있습니다. Fig1D의 의미에서 수명이 Mirtazepine 농도 7 기능으로 꾸몄다 있습니다. 각 데이터 포인트는 7-12 인구의 평균 수명, 잘 다른 각 생활을 나타냅니다. 잘마다 동물의 숫자 (5-15 동물) 비교적 낮은 경우에도 오차 막대에서 볼 수 있듯이 잘 – 투 – 잘 편차는 상대적으로 작다. 그림 1. 수명 분석을 기반으로 microtiter 플레이트 정확하게 수명의 변화에 문헌에 보고된를 재현한. (A) 샘플 데이터는 Excel 스프레드 시트에서 수집했습니다. 각 계수 세션 날짜 동안 잘의 좌표와 살고 죽은 동물의 숫자를 기록했다. 실험의 시작 부분에서, 각 우물에 동물의 총 개수가 결정되었습니다. (B) 야생 유형의 생존 곡선 (N2) 동물 20 성장 ° C와 25 ° C. 수명에 영향을 변이를 들고 종자의 (C) 서바이벌 곡선. 네개의 변종은 20 ° C.에 병렬로 assayed되었습니다 Mirtazepine 취급 N2 동물 (D) 선량 반응 곡선. 평균 수명은 Mirtazepine 농도의 함수로 꾸몄다 있습니다. 오류 막대는 조건 1 일 8 웰스의 SEM을 나타냅니다. 5. 자료. M9 버퍼, 1000 ML 6g 나 2 HPO 4 3g KH 2 PO 4 5g NaCl 0.25 g MgSO 4 7H 2 O ∙ 1000 ML에 탈이온수 추가 압력솥 Potassiumphosphate 버퍼 산도 6.0 1000 ML 136g KH 2 PO 4 900 ML에 탈이온수 추가 5M 코와 6.0 산도를 조정 1000 ML에 탈이온수 추가 압력솥 추적 금속 솔루션 1.86 g 나이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ 0.20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O 0.29 g ZnSO 4 7H 2 O ∙ 0.016 g CuSO 4 1000 ML 물을 deionized 압력솥과 어둠 속에 저장합니다. S – 기초 중간, 1000 ML 5.9 g NaCl 1M 칼륨 나트륨, 산도 6.0의 50 ML 1000 ML 물을 deionized 압력솥 5mg / ML 콜레스테롤 (잇 – OH에 용해) 1 ML을 추가합니다 다음 솔루션은 식지합니다. 칼륨 구연 산염의 1M 1000 ML 268.8 g의 tripotassium의 구연 산염 26.3 구연산 산성 일수화물 900 ML 탈이온수 추가 5M 코와 6.0 산도를 조정 1000 ML에 탈이온수 추가 압력솥 S – 완료 중간, 1000 ML 977 ML S – 기저 10 ML 1M 칼륨의 구연 산염의 산도 6 (살균) 10 ML 트레이스 금속 용액 (살균) 3 ML 1M CaCl 2 (살균) 3 ML 1M MgSO 4 (살균) NGM의 한천 3.0g NaCl 2.5G Pepton(카제인에서 췌장 소화) 17g 아가르 탈이온수 975 ML과 감동 바 추가 압력솥 55 식다 autoclaving 후에 ° C 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 : 1M CaCl 2 (멸균)의 0.5 ML 에탄올의 5mg / ML 콜레스테롤 1 ML 1M MgSO 4 (멸균) 1 ML 25 ML의 Potassiumphosphate 버퍼, 산도 6.0 (멸균) TB 1000 ML 12g Bacto Tryptone 24g의 효모 추출 4 ML의 글리세롤 900 ML 탈이온수 추가 압력솥 55 식다 autoclaving 후에 ° C 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 : 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 100 ML을 추가 0.6 MM Fluorodeoxyuridine (FUDR, 시그마 고양이 # F0503), 1000 ML 100 MG FUDR S – 완전 무균 670 ML에 용해, 10 ML 45 ML aliquots합니다. -20 ° C.에 저장 100 MG / ML Carbenicillin, 10 ML 1g Carbenicillin 10 ML 무균 탈이온수 무균 여과액 및 나누어지는 -20 ° C.에 저장 50 μg / ML의 최종 농도에서 사용 250ug / ML Amphotericin B, 4 ML 1mg Amphotericin B 4 ML 잇 – OH -20 ° C에서 보관 0.1 μg / ML의 최종 농도에서 사용