Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

Descrizione: Il protocollo è diviso in quattro parti. Parte 1 descrive come preparare i batteri alimentazione. Parte 2 descrive come preparare la cultura worm. Parte 3 descrive come punteggio la durata della vita. Parte 4 mostra alcuni risultati rappresentativi, e parte 5 descrive come preparare le soluzioni richieste. Esperimenti di durata richiedere diverse settimane per essere completato. Per ogni passo della settimana protocollo, giorno e ora del giorno è incluso per facilitare la pianificazione. La fase L4 (giorno 0) viene utilizzata come punto di riferimento per l'intero protocollo. 1. Preparazione di batteri alimentazione Questa sezione descrive la preparazione dei batteri alimentazione. Le specifiche E. coli ceppo usato per alimentare C.elegans si chiama OP50. Prima di questo protocollo, per evitare la contaminazione incrociata della cultura verme con altri batteri, il ceppo OP50 è stato fatto Carbenicillin / ampicillina resistenti 21. Preparare la OP50 4-5 giorni di anticipo. Tutti i materiali a contatto con OP50 devono essere sterili. Giorno -7: Giovedi (settimana 1): Seminare 5 ml di TB contenente 100 mg / ml Ampicillina e 0,1 mg / ml amfotericina B con un unico OP50 colonia e incubare per una notte a 37 ° C in un agitatore batterica. -6 ° giorno: Venerdì (settimana 1). Mattina 8:30. Seminare presto per lasciare il tempo sufficiente per la cultura di raggiungere la saturazione Diluire la cultura durante la notte di OP50 1:2000 in 300 TB ml contenente 50 mg / mL di ampicillina. Incubare la coltura batterica in uno shaker per 8-12 ore a 37 ° C fino a saturazione. Non permettere che la cultura di crescere più di 14 ore. Trasferire il OP50 in una sterile, pre-ponderato tubo di centrifugazione. Agglomerare le OP50 tramite centrifugazione per 10 min a 3500 rpm (2200 xg) in una centrifuga da tavolo. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet OP50 in acqua sterile e ri-pellet per centrifugazione. Ripetere questa lavare due volte. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere con attenzione tutta l'acqua residua. L'acqua non dovrebbe essere lasciato nel tubo. Pesare il tubo di centrifugazione che contiene il pellet e sottrarre il peso del tubo di centrifugazione vuoto al fine di determinare il peso del pellet. Accuratamente risospendere il pellet in S-completo ad una concentrazione di 100 mg / ml. Senza grumi dovrebbe essere lasciato. La concentrazione di 100 mg / mL OP50 dovrebbe corrispondere a 2 x 10 10 batteri / ml. Utilizzare uno spettrometro foto per determinare il numero di batteri per ml se la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri per mL è noto. Se necessario, regolare la concentrazione della soluzione di alimentazione OP50 a 2 x 10 10 batteri / ml. Conservare il OP50solution a 4 ° C fino a quando non viene utilizzato per la cultura worm. 2. Preparazione di una cultura Worm sincrono Questa sezione descrive la preparazione della cultura worm. Il suo obiettivo è quello di generare un età sincrono popolazione di vermi. Tutti i materiali che entrano in contatto con C.elegans dopo il trattamento con candeggina al punto 5 devono essere sterili. Le piastre sono mantenuta a 20 ° C, salvo diversamente indicato. -6 ° giorno: Venerdì (settimana 1), 16:00: trasferimento degli animali ad un piatto fresco Prendete un piatto 5-10 NGM vecchio giorno in cui la maggioranza della popolazione è composto da larve di vermi L1 fame. Sterilizzare una spatola metallica da poco che il riscaldamento nel corso di un becco Bunsen. Lasciate raffreddare. Utilizzare la spatola raffreddato a tagliare pezzi di agar dalla piastra contenente i vermi affamati. Trasferire alcuni di questi pezzi su un piatto fresco 10 teste di serie centimetri NGM con OP50. Incubare per ca. 65 ore a 20 ° C fino a quando la maggioranza della popolazione è costituito da vermi adulti gravido. Il tempo necessario per gli animali L1 fame di crescere e diventare adulti gravido può variare da ceppo a ceppo. -3 Giorni: Lunedi (settimana 2) 10:00: Stabilire una popolazione sincrona Raccogliere i vermi dalla piastra 10 cm per lavarli via il piatto con 5-10 ml di acqua sterile. Trasferire il worm / soluzione di acqua in un tubo da 15 ml. Lavare i vermi per centrifugazione 2 minuti in una centrifuga da tavolo a 1200 rpm (280 xg). Gettare il surnatante e aggiungere 10 ml di acqua. Ripeti. Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di candeggina appena preparato / soluzione di NaOH (2,5 candeggina mL, 1 mL 10N NaOH, 6.5 mL H 2 O). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente fino a quando il worm rompere. Assicurati di vortice delicatamente ogni minuto. Monitorare l'andamento della reazione sotto il microscopio da dissezione. Non appena tutti gli adulti sciogliere, aggiungere 5 ml di M9 tampone per neutralizzare la reazione. Lavare le uova tre volte con 10 mL di tampone M9 per centrifugazione 2 min a 2500 rpm (1100 xg). Lavare le uova una volta con 10 mL S-completo per centrifugazione 2 min a 2500 rpm (1100 xg). Rimuovere il surnatante, aggiungere 10 mL S-completo e trasferire la soluzione di un nuovo tubo da 50 ml. Aggiungere 30 ml di S-completo per un volume finale di 40 ml. Agitare delicatamente il tubo durante la notte a temperatura ambiente su un nutator o dispositivo simile. -2 ° giorno: Martedì (settimana 2), ore 12:00: Seed gli animali in piastre Nell'ambito di applicazione dissezione, verificare se i vermi nati durante la notte. Determinare la concentrazione di vermi nella S-soluzione completa contando il numero di worm in 10 microlitri gocce utilizzando un ambito dissezione. Contare almeno 10 gocce per ogni campione. Risospendere i vermi ad una concentrazione di 80-100 worm / mL in S-completo. Aggiungi Carbenicillin (stock 100 mg / mL) a una concentrazione finale di 50 mg / ml e amfotericina B (stock 250 mcg / mL) ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml. Agitare su un nutator. Se la preparazione di grandi quantità di worm, utilizza una nunclon 600 mL recipiente con coperchio del filtro. Alle 2:30 pm aggiungere il OP50 preparato nella parte 1 ad una concentrazione finale di 6 mg / ml (= 1,2 x10 9 batteri / mL). Riportare la OP50 a 4 ° C. Trasferire 120 microlitri della soluzione del worm/OP50 in ciascun pozzetto di una piastra 96 ​​pozzetti. Usa Piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente. Assicurarsi di mantenere i vermi in sospensione durante il pipettaggio. Sigillare la piastra con un nastro sigillante per evitare la contaminazione e l'evaporazione. Agitare la piastra su micropiastra shaker per 2 minuti e incubare per 2 giorni a 20 ° C fino a quando gli animali raggiungono lo stadio L4. Day 0: Giovedi (settimana 2) prima di mezzogiorno: Sterilizzare gli animali con l'aggiunta di Fluorodeoxyuridine (FUDR) Per sterilizzare gli animali aggiungere 30 ml di una soluzione 0,6 mM magazzino FUDR in ciascun pozzetto. Questo passo porta il volume finale in ogni pozzetto a 150 microlitri e riduce la concentrazione finale di OP50 da 6 mg / ml a 5 mg / ml (1×10 9 batteri / mL). Sigillare la piastra con sigillanti a nastro e agitare per 2-3 minuti su una piastra di microtitolazione shaker. Se l'OP50 è stato aggiunto alle 2:30 del giorno -2, è importante che il FUDR si aggiunge prima di mezzogiorno. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore Giorno 1: Venerdì (settimana 2): Aggiungi farmaci per la cultura Entro le ore 9:00 la maggior parte degli animali devono essere gravide e le uova contengono diversi ciascuno. Aggiungere i farmaci il cui effetto sulla durata di vita è da verificare presso la concentrazione desiderata. Se sciogliere la droga in DMSO le concentrazioni finali di DMSO non deve superare lo 0,6%, come DMSO concentrazioni superiori allo 0,6% C.elegans accorciare la durata della vita. Dopo l'aggiunta del farmaco, sigillare le piastre con nastro isolante e agitare per 2-3 minuti su una micropiastra shaker. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore L'aggiunta di questi farmaci può occasionalmente uccidere alcuni animali per piastra, specialmente se si usa un altro solvente che l'acqua. Utilizzare un microscopio invertito per verificare la presenza degli animali morti. In generale, ci dovrebbe essere inferiore a 10 animali morti per 96 pozzetti. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore. 4 ° giorno: Lunedi (settimana 3): Modifica sigillanti Per consentire ossigeno fresco per entrare nella cultura rimuovere il sigillante, attendere 1 minuto e richiudere il piatto. Agitare la piastra per 2-3 minuti su un agitatore micropiastra. Ripetere una volta alla settimana. 5 ° giorno: Martedì (settimana 3): Aggiungi OP50 nuovo per evitare la fame Aggiungere 5 ml di mg / ml 100 OP50 soluzione che è stata preparata in parte 1 a ciascuno dei 96 pozzetti per evitare la fame. 3. Punteggio di vita. Questa sezione descrive come la sopravvivenza della popolazione verme sincronizzata della parte 2 viene monitorata fino a quando gli animali sono morti. Per osservare gli animali nel Piastre a 96 pozzetti, utilizzare un microscopio rovesciato con un obiettivo 2x o 2.5x. Record di dati di sopravvivenza per tre volte alla settimana; Lunedi, Mercoledì e Venerdì. Utilizzare il movimento per stabilire se gli animali sono vivi o morti. Forte luce, la luce blu soprattutto, induce gli animali a muoversi. Non rimuovere gli animali morti dal test. Occasionalmente, gli animali che non si muoveva e sono stati determinati morti nel conteggio precedente potrebbe passare più tardi. Al giorno 0, all'inizio dell'esperimento contare il numero totale di vermi in ogni pozzetto. Censore pozzi che contengono più di 18 animali l'analisi come animali in questi pozzi non avrà abbastanza OP50 e mostrerà effetti della restrizione dietetica. Al fine di aumentare la possibilità che gli animali muovono scuotere il 96 pozzetti su una micropiastra shaker per 2 minuti. prima del conteggio. In ogni conteggio data di registrazione della sessione, e il numero di animali chesi muovono come animali vivi. Movimento nel liquido è molto più facile che su terreni solidi e può essere indotta da luci forti. L'utilizzo di un ingrandimento superiore può aiutare a posto movimenti molto sottili come quelli della punta della faringe. Tali movimenti sottili sono spesso l'unico movimento osservato negli animali molto vecchi. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore Ripetere il passo 2-4 ogni due o tre giorni fino a quando tutti gli animali sono morti. 4. Rappresentante dei risultati. Questa sezione mostra un esempio di come tenere registri relativi ai dati durata generate da questo test e alcuni risultati rappresentativi. La figura 1A mostra un esempio di come registrare i dati vita durante questo test. Un foglio Excel viene utilizzato per tenere traccia della sopravvivenza delle popolazioni di ogni bene. Per ogni bene è coordinare nel piatto, ceppo, droga, la concentrazione del farmaco e il numero totale di animali vivi il giorno 0 (X0) è registrato all'inizio dell'esperimento. Registrare la data, così come il numero di vivere e di animali morti tre volte la settimana per seguire la sopravvivenza delle popolazioni diverse in ciascun pozzetto. Per tracciare il grafico dei risultati, calcolare la frazione di animali vivi per ogni giorno e la trama come una funzione del tempo in giorni. P-valori devono essere calcolati utilizzando pacchetti statistici come STATA o software simili. La durata media di C.elegans dipende dalla temperatura. Figura 1B mostra che le variazioni di temperatura dipendenti in vita sono accuratamente riprodotti dal microtitolazione base durata del test 22. Allo stesso modo, il test micropiastra riproduce cambiamenti nella vita da mutanti segnalato per durata della vita che si differenziano dagli animali selvatici N2 tipo 23-24 25 (Fig. 1C). Il test può anche essere usato per fare dichiarazioni più quantitativa. In media Fig1D durata della vita è rappresentata in funzione della concentrazione Mirtazepine 7. Ogni punto di dati rappresenta la durata media di 7-12 popolazione, ognuno vive in un altro bene. Anche se il numero di animali per bene è relativamente bassa (5-15 animali) il ben-to-bene variazione è relativamente piccolo come si può vedere dalle barre di errore. Figura 1. La micropiastra basato durata saggio riproduce accuratamente cambiamenti nella vita riportati in letteratura. (A) Esempio di dati raccolti in un foglio di calcolo excel. Durante ogni sessione di conteggio data, coordinate del bene e del numero di animali vivi e morti è stato registrato. All'inizio dell'esperimento, il numero totale di animali in ciascun pozzetto è stata determinata. (B) Curva di sopravvivenza di tipo selvatico (N2) gli animali cresciuti a 20 ° C e 25 ° C. (C) Le curve di sopravvivenza dei ceppi portatori di mutazioni che influenzano la durata della vita. Tutti e quattro i ceppi sono stati analizzati in parallelo a 20 ° C. (D), curva dose-risposta Mirtazepine N2 animali trattati. Media durata della vita è rappresentata in funzione della concentrazione Mirtazepine. Barre di errore indicano la SEM di 8 pozzi per condizione. 5. Materiali. M9 tampone, 1000 ml 6 g Na 2 HPO 4 3 g di KH 2 PO 4 5 g NaCl 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml Autoclave Potassiumphosphate pH 6.0, 1000 ml 136 g KH 2 PO 4 Aggiungere acqua deionizzata a 900 ml Regolare il pH a 6,0 con KOH 5M Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml Autoclave Metalli in tracce soluzione 1,86 g di Na 2 EDTA 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O 0,016 g di CuSO 4 1000 mL di acqua deionizzata Autoclave e conservare al buio. S-basale medio, 1000 ml 5,9 g di NaCl 50 ml di fosfato di potassio 1M, pH 6.0 1000 mL di acqua deionizzata Autoclave Lasciar raffreddare la soluzione e si aggiunge 1 ml di colesterolo 5 mg / ml (sciolto in Et-OH). Citrato di potassio 1M, 1000 ml 268,8 g tripotassico citrato 26,3 acido citrico monoidrato Aggiungere 900 ml di acqua deionizzata Regolare il pH a 6,0 con KOH 5M Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml Autoclave S-completo di media, 1000 ml 977 mL S-basale 10 ml 1M citrato di potassio pH 6 (sterile) 10 ml Trace metalli soluzione (sterile) 3 ml 1M CaCl 2 (sterile) 3 ml 1M MgSO 4 (sterile) NGM agar 3,0 NaCl 2.5g peptone(A partire dalla caseina, pancreas digerire) Agar 17g Aggiungere acqua deionizzata a 975 ml e un bar mescolando Autoclave Dopo la sterilizzazione in autoclave raffreddare a 55 ° C e aggiungere i seguenti componenti: 0,5 mL di 1M CaCl 2 (sterile) 1 mL di Colesterolo 5 mg / ml in etanolo 1 mL di 1M MgSO 4 (sterile) Potassiumphosphate 25 mL di tampone, pH 6,0 (sterile) TB, 1000 ml 12g Bacto Triptone 24 g Estratto di lievito 4 mL di glicerolo Aggiungere 900 ml di acqua deionizzata Autoclave Dopo la sterilizzazione in autoclave raffreddare a 55 ° C e aggiungere i seguenti componenti: aggiungere 100 ml di 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 0,6 mm Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml 100 mg FUDR Sciogliere in 670 mL sterili S-completo, fanno 10 ml o 45 ml aliquote. Conservare a -20 ° C. 100 mg / ml Carbenicillin, 10 mL 1 g Carbenicillin 10 ml di acqua sterile deionizzata Sterile filtrato e aliquota Conservare a -20 ° C. Utilizzare ad una concentrazione finale di 50 mg / ml 250ug / ml di amfotericina B, 4 mL 1mg amfotericina B 4 mL Et-OH Conservare a -20 ° C L'uso ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml