מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב
Summary
בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה למדידת<em> Caenorhabditis elegans</em> תוחלת החיים בשנת 96 צלחות microtiter היטב.
Abstract
תוחלת החיים היא תהליך ביולוגי מוסדר על ידי מספר מסלולים גנטיים. אסטרטגיה אחת כדי לחקור את הביולוגיה של ההזדקנות היא ללמוד חיות הנמל מוטציות מרכיבי גיל הרגולציה המסלולים. אם מוטציות אלו לטרוד את הפונקציה של המסלול לגיל הרגולציה, ולכן לשנות את תוחלת החיים של האורגניזם כולו, הם מספקים תובנות מכניסטית חשוב 1-3.
אסטרטגיה נוספת לחקור את הרגולציה של תוחלת החיים היא להשתמש מולקולות קטנות להפריע גיל הרגולציה המסלולים. נכון להיום, מספר מולקולות ידועים להאריך את תוחלת החיים ביצורים שונים מודל משמשים ככלים ללמוד את הביולוגיה של ההזדקנות 4-16. מספר מולקולות מזוהה עד כה הוא קטן לעומת "הכלים" הגנטי הזמין מחקר על הביולוגיה של ההזדקנות.
Caenorhabditis elegans היא אחד הדגמים העיקרון המשמש במחקר ההזדקנות בגלל גנטיקה מעולה שלה אורך חיים קצר של שלושה שבועות. לאחרונה, C.elegans התפתחה כאורגניזם מודל מבוסס פנוטיפ מסכי סמים 5,7,16-20 בגלל גודלו הקטן ואת יכולתה לצמוח הצלחות microtiter.
כאן אנו מציגים assay למדוד C.elegans תוחלת החיים ב 96 צלחות microtiter היטב. Assay פותחה בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות להאריך את תוחלת החיים C.elegans 7. האמינות של assay הוערך בדיקות מרובות: ראשית, על ידי מדידת תוחלת החיים של חיות הבר סוג גדל בטמפרטורות שונות; השני, על ידי מדידת תוחלת החיים של מוטנטים עם תוחלת החיים משתנה; שלישי, על ידי מדידת השינויים תוחלת החיים בתגובה ריכוזים שונים Mirtazepine של דיכאון. Mirtazepine יש בעבר הוכח להאריך את תוחלת החיים ב C.elegans 7. התוצאות של בדיקות אלה מראים כי assay הוא מסוגל לשכפל את הממצאים הקודמים של מבחני אחרות הוא כמותי. הפורמט microtiter גם עושה את זה assay תוחלת החיים תואם למערכות אוטומטיות טיפול נוזלי מאפשר השתלבות בפלטפורמות אוטומטיות.
Protocol
Discussion
פרוטוקול שהוצג מאפשר מדידת C.elegans תוחלת החיים ב 96 צלחות microtiter היטב. כפי שמוצג בתוצאות נציג בסעיף זה אמין משכפל ממצאים קודמים ומספק מידע כמותי. שימוש assay זה יש לנו הוקרן בהצלחה והשפעתם על תוחלת החיים C.elegans מעל 89,000 מולקולות.
לצורך ההקרנה סמים, מדידת תוחלת החיים בתבנית 96 microtiter גם צלחת יש מספר יתרונות על פני assay התקשורת הקלאסית מוצק. זה מפחית את העבודה הדרושה התקשורת הכנה, את כמות שטח הדגירה, ואת כמות התרופה הנדרשת. הפורמט 96-היטב את ההגדרה מיקרוסקופיה לאפשר אוטומציה של assay כולו הקרנות תפוקה גבוהה.
במהלך הפיתוח של assay ערכים מרובים עבור כל משתנה ושילובים של הנ"ל נבדקו השפעתם על C.elegans תוחלת החיים. בדיקות אלה כללו ריכוז OP50 שונים הנעים בין 3-10 מ"ג / מ"ל (3, 4, 6, 8, 10 מ"ג / מ"ל), מספר שונה של תולעים בכל טוב החל 7-45 (7, 10, 15, 22, 45 תולעים / טוב), כרכים תרבות שונים הנעים בין 40 ל 150 לכל μL היטב (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL), וכן שינויים בהרכב חיץ. אם נמאס עם OP50 Carbenicillin עמידים, ציין לא Carbenicillin ולא amphotericin B בריכוזים נמצאו להשפיע C.elegans תוחלת החיים. רעד עדין רציף של הצלחות, כמו מומלץ לעיתים קרובות בתרבות C.elegans נוזלי, נמצא לוותר על בנפחים קטנים המשמשים assay זה. רעד עדין אך נדרש אם microtiter צלחות עם בארות גדולים יותר לשמש. הערכים המצוינים בפרוטוקול זה נבחרו בקפידה על בסיס השוואה סטטיסטית של תנאים שונים שנבדקו.
התכונה המפתיעה ביותר של assay זה כנראה העובדה C.elegans יכולים להישמר 96 צלחות היטב חתומות עם הקלטת. Side-by-הצד השוואות לא גילה כל הבדל בין תוחלת החיים של חיות בתרבית unsealed צלחות, צלחות חתום עם אוטם ניילון, או צלחות חתום עם חומרי איטום המאפשרים חילופי אוויר. בכל שלושת התנאים, החיות פיתחו homogenously מאוד L1 למבוגרים הרה להולדת בתוך 65 שעות והראה תוחלת החיים דומה מאוד. בעלי חיים גדל במקביל על NGM פיתחו מעט מהר יותר, אבל ההבדל הזה היה עצמאי של היעדרות או נוכחות של אוטם.
הפרוטוקול שהוצג מבוסס על חיידקים חיים, אבל יכול להיות מותאמים עבור חיידקים מתים. עם זאת, assay נוזל חיידקים לשרוד אחד יכול להתרבות במהירות לאכלס מחדש את התרבות. בידיים שלנו, הדרך היחידה אמין כדי להרוג חיידקים עד כדי כך שהם יכולים לשמש לתרבות נוזלי על ידי טיפול ממושך של החיידקים עם קרינת גמא.
נקודה אחת חשוב לקחת בחשבון בתכנון של ניסוי תוחלת החיים הוא הכוח של גילוי. תלוי בגודל ההשפעה, ההשפעה של התרופה עניין חייבים להיבדק בבארות מרובים. ב assay טיפוסי 4 סמים מטופלים 4 בארות שליטה, המקביל בערך 40-50 חיות כל, צריך להספיק כדי לזהות עלייה של 30% בתוחלת החיים ב 95% יותר מאשר הניסויים. עליות של 14% מזוהים רק 60% מהמקרים ולכן דורשים בארות לשכפל יותר.
שפע של נתוני תוחלת החיים שנוצר על ידי assay זה עשוי לשמש לפיתוח הניסוי או זן ספציפי מודלים Gompertz מצדי 1. אלה מודלים Gompertz מועילים כדי לקבוע את הכוח של איתור כדי להעריך את מספר תוצאות חיוביות וגם שליליות שווא עבור בקנה מידה גדול המסכים. אנו לאמת את התחזיות של מודלים אלה בניסויים עיוור והשתמשו בהם כדי להעריך את מספרם של תשלילים כוזב מסכים גדולים (תוצאות לא פורסם).
לסיכום, אנו צופים כי assay הציג תהיה תועלת רבה לזהות מולקולות קטנות להאריך את תוחלת החיים של C.elegans ו ללמוד את המנגנונים.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרוטוקול זה פותח במקור על ידי Xiaolan יה מיכאל Petrascheck על פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן בסיאטל במעבדה של לינדה באק. הגרסה המפורטת לעיל הוכנה על מנת להפוך את התהליך כולו לרשות הציבור הרחב. אנו מודים קרול טיילור, שרה LeBoeuf ואנדי Tomacelli עבור אנושות בקריאת פרוטוקול. זהו כתב היד # 2866 מן המחקר סקריפס המכון. המעבדה Petrascheck ממומנת על ידי תוכנית נוברטיס ADI.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amphotericin B | Calbiochem | cat# 171375 | Also called Fungizone | |
| FUDR | Sigma-aldrich | cat# F0503 | FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water | |
| Mianserin | Sigma-aldrich | M2525-250MG | Use as positive control at 50μM final concentration | |
| Cyproheptadine | Sigma-aldrich | cat#C6022-MG | Alternative positive control at 10 μM final concentration | |
| Sealing Tape | Nunc | cat# 236370 | Polyester, non-sterile | |
| 96 well plate | Falcon | cat# 351172 | Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene | |
| Nunclon flask | Nunc | cat# 178883 | used for large volumes |
Referenzen
- Johnson, T. E. Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging. Science. 249, 908-912 (1990).
- Kenyon, C. J. The genetics of ageing. Nature. 464, 504-512 (2010).
- Finch, C. E., Ruvkun, G. The genetics of aging. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).
- Wilson, M. A. Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5, 59-68 (2006).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307, 258-262 (2005).
- McColl, G. Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 553-556 (2007).
- Srivastava, D. Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans. Biogerontology. 9, 309-316 (2008).
- Wood, J. G. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430, 686-689 (2004).
- Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 7, 305-317 (2008).
- Onken, B., Driscoll, M. Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).
- Wu, Z. Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).
- Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. Life extension in Drosophila by feeding a drug. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).
- Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster. Biogerontology. 11, 45-52 (2010).
- Melov, S. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289, 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).
- Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson’s disease for high-throughput drug screenings. Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).
- Kwok, T. C. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Moy, T. I. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Lakowski, B., Hekimi, S. Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes. Science. 272, 1010-1013 (1996).
