Développement de ovaire de hamster chinois-hôte dosages de protéines cellulaires utilisant la technologie acoustique microparticules membranaires

1. Préparation de microparticules Anticorps étiquette utilisant la biotine NHS Chimie Détermination du degré de biotinylation Conjugué avec des billes de streptavidine anticorps biotinylé Resuspendre les perles dans le flacon d'origine par vortex pendant 1-2 minutes Aliquoter le volume souhaité de perles dans un tube à centrifuger Laver les billes 3 fois avec PBST: Placer le tube contenant les billes sur l'aimant pendant 2 minutes Retirer le surnageant par aspiration avec le tube sur l'aimant. Soyez prudent de ne pas perturber les perles Retirer le tube de l'aimant et ajouter 1 ml de PBST Vortex pendant 20 secondes pour remettre en suspension les perles Centrifuger pendant 5 secondes pour enlever les perles de la PAC Répéter deux fois plus 2.3.1-2.3.5 Après le troisième lavage lieu le tube sur l'aimant et aspirer le PBST Ajouter anticorps biotinylé aux billes et resuspendre Si nécessaire porter le volume de l'anticorps biotinylé jusqu'à 300 uL de PBS. Si le volume d'anticorps est déjà supérieure à 300 ul ne pas ajouter de PBS Incuber la suspension de billes / anticorps pendant 30 minutes à température ambiante sur l'agitateur vortex ou le tube des rotateurs Laver 3 fois avec PBST comme dans l'étape 3. Bloc perles avec biotinylé BSA Après le troisième lavage ajouter 10 pg / mg de BSA biotinylé, ajuster le volume à 300 ul avec du PBS, si nécessaire, et incuber sous agitation pendant 30 minutes Laver 3 fois avec PBST comme dans l'étape 3 Resuspendre les perles dans 100 uL de BSA PBS/0.05%. L'azide de sodium peut être ajouté pour le stockage à long terme Utilisation de la norme du NHS protocoles fluorescéine, fluoresceinate l'anticorps détecteur Déterminer le degré de Fluorescination 2. HCP – Développement Préparer des solutions de travail: Anticorps marqué à la fluorescéine (FL-Ab): La plupart des cellules CHO-HCP dosages utilisent Fl-Ab à une concentration finale de 400 ng / mL. Le FL-Ab est ajouté en tant que ¼ du volume d'essai final, donc la concentration de la solution de travail est de 1,6 mg / ml. Préparer cette solution en diluant avec de stock Flab BioScale billes / Flab diluant. Perles: La plupart des cellules CHO-HCP dosages utilisent des billes à une concentration finale de 2×10 5 billes / mL. Le réactif perles constitue ¼ du volume d'essai final, donc la concentration de la solution de travail est 8×10 5 billes / mL. Préparer cette solution en diluant stock de billes avec billes BioScale / Flab diluant. Vortex du stock de perles et de s'assurer que toutes les perles sont en suspension avant de retirer une partie aliquote. Tampon: La composition du tampon de migration peut être optimisé pour les anticorps utilisés pour développer le test, mais plusieurs CHO-HCP tests ont été développés en utilisant 10 mM de tampon HEPES, 1% de Tween, pH 7,5. BioScale a développé un additif pour le tampon courant (fournie avec le kit de développement) qui est ajouté au tampon à une concentration de 1% avant de l'utiliser. Diluer étalons et d'échantillons avec le diluant échantillon BioScale. 3. ViBE Système Set Up Tournez le Workstation Vibe Branchez l'alimentation du système et des déchets Premier système Insérez une cartouche ViBE Route des tubes Préparer modèle de test en remplissant la feuille intitulée «Exemple de configuration". BioScale offre la possibilité d'avoir un modèle de test pour chaque dosage Workstation ViBE. Cela permet à l'utilisateur de modifier et enregistrer des notes spécifiques dans les "Notes" feuille de modèle pour des dosages différents conserver un dossier complet de l'expérience. Modèle de test initial mis en place: Commencez par remplir le tableau (en haut à gauche) de la gamme de concentration de ces normes dans le test dans le "Setup Sample" feuille. Ensuite, entrer des informations supplémentaires dans le tableau à droite de l'normes (Configuration simple colonne Lire, Ajouter un réactif et réactif Deux configurations Ajouter) pour charger le Workstation ViBE combien de longs échantillons doivent incuber, quel volume de réactif doit être transféré , combien de temps l'accumulation de l'échantillon doit être, et si conditionné capteur et la décontamination des sondes et des cartouches sont nécessaires, etc Remplissez le disposition de la plaque. Charger l'échantillon / réactifs en plaques. La Vibe fournira les volumes nécessaires à la plaque de réactif. Le volume d'échantillon peut varier, mais dans la moitié d'un volume de dosage total de 120 uL est un bon point de départ. Appliquer couvre la plaque. Charge plaques sur le pont poste de travail. Exécutez le test de démarrage Assistant, passez par l'assistant et commencer dosage. 4. Les résultats représentatifs Figure 1: immunoessai sandwich AMMP </p> Sur un poste ViBE, un test mesure la concentration d'antigène AMMP. Le signal est mesuré lorsque l'anticorps-antigène-billes haptène se lie à la sonde à travers l'haptène / anti-haptène interaction. Régénération apporte le capteur revient à l'état commence par enlever les complexes immuns. Figure 2: CHO-HCP courbe de calibration du dosage du PMMA Figure 2 ci-dessus est un exemple d'une courbe CHO HCP AMMP calibration du dosage. L'analyse peut être effectuée dans les échantillons de l'ensemble du flux d'épuration, y compris le réacteur avec une grande précision et la reproductibilité. Figure 3: Protéines Une courbe de calibration Assay AMMP La figure 3 est une courbe de calibration pour une protéine résiduelle Une analyse du PMMA, réalisée avec une protéine résiduelle VIBE une trousse de dosage. Le même kit peut être utilisé pour un rapide essai avec une période d'incubation de 30 minutes, ou pour des résultats plus sensibles et plus large gamme dynamique, avec une période d'incubation plus longue, sans perte de précision ou de précision, qui tous deux sont généralement mieux que leurs équivalents en ELISA dans des usagers les mains Figure 4: Produit Titer AMMP Assay La station de travail ViBE peut également être utilisé pour un dosage Titer produit, résultats présentés dans la figure 4. Réalisée différemment que d'autres dosages PMMA, ce test ne nécessite pas de traitement de l'échantillon autre que la dilution simple, ou de perles, et la quantification a été vérifié dans "sans essorage" échantillons contenant plus de 10 millions de cellules sur une large gamme de viabilités. Figure 5: courbe standard de dosage AMMP pour le dosage de la TPS-GADD34 biomarqueur Montre la figure 5 est une courbe standard de signal obtenu par le BioAnalyzer ViBE (Groupe A) ou la technologie en utilisant AlphaScreen recombinant GST-GADD34. Résultats sur la plate-forme ViBE ont été d'environ un journal plus sensibles en utilisant les mêmes anticorps. AMMP s'appuie sur la mesure de moins de particules plus grandes mais encore les avantages de la capture en phase solution et la formation de complexes de détection. Figure 6: Courbe AMMP dosage standard pour la TPS-GADD34 dans l'échantillon de la tumeur Dans la figure 6, l'induction de GADD34 partir CWR22 xénogreffes a été testé dans la présence ou l'absence d'un inhibiteur du protéasome boronate que analysées soit par le BioAnalyzer ViBE (Groupe A) ou AlphaScreen (Groupe B). La plate-forme ViBE était capable de produire sensibles, des résultats reproductibles dans le in vivo xénogreffes tumorales tandis que le signal a été stoppée avec AlphaScreen mg de protéine accrue. Cet exemple montre la puissance de la technologie dans des échantillons de PMMA très complexe. Grâce à la puce de détection sensible et une grande efficacité de l'aimant à proximité de la chips, un faible nombre de microparticules magnétiques peuvent efficacement et de façon reproductible récupérer des cibles de faible abondance au milieu de la complexité de lysées cellulaire (y compris les réactifs de lyse) et les débris de sang.