En metod för RNA-interferens (RNAi) genom injektion av dsRNA till unfed fästingar beskrivs. RNAi är den mest använda gener tystas teknik i fästingar där användningen av andra metoder för genetisk manipulation har varit begränsade.
Fästingar är obligata hematophagous ektoparasiter av vilda och tama djur och människor, och anses vara andra världen över att myggor som vektorer av sjukdomar hos människan 1 och våra viktigaste faktorer som påverkar boskap över hela världen 2. Fästingar klassificeras i underklassen Acari, Parasitiformes ordning, underordning Ixodida och distribueras över hela världen från Arktis till tropiska regioner 3. Trots ansträngningar att kontrollera fästing angrepp, dessa ektoparasiter är fortfarande ett allvarligt problem för människors och djurs hälsa 4,5.
RNA-interferens (RNAi) 6 är en nukleinsyra baserad omvänd genetisk strategi som omfattar störningar av genuttryck för att bestämma geners funktion och dess effekt på en metabolismväg. Små störande RNA (siRNA) är effektor molekyler av RNAi väg som initieras av dubbelsträngat RNA (dsRNA) och resulterar i en potent sekvensspecifika nedbrytning av cytoplasmiska mRNA som innehåller samma sekvens som dsRNA utlösa 7-9. Post-transkription geners uttryck mekanismer initieras av dsRNA har upptäckts i alla eukaryoter studerat hittills, och RNAi har snabbt utvecklats i en mängd olika organismer som ett verktyg för funktionsgenomik studier och andra program 10.
RNAi har blivit det mest använda gener tystas teknik i fästingar och andra organismer där alternativa metoder för genetisk manipulation inte är tillgängliga eller är otillförlitliga 5,11. Den genetiska karakterisering av fästingar har begränsats till aktuell tillämpning av RNAi 12,13. Under den korta tid som RNAi har funnits, har det visat sig vara ett värdefullt verktyg för att studera funktionen kryssa gen, en karakterisering av den fästingburna patogen gränssnitt och screening och karakterisering av fästing skyddande antigen 14. Häri, är en metod för RNAi genom injektion av dsRNA i unfed fästingar beskrivs. Det är troligt att de kunskaper som förvärvats från denna experimentella strategi kommer att bidra markant till förståelsen av grundläggande biologiska system och utveckling av vacciner för att styra fästing angrepp och förhindra överföring av fästingburna patogener 15-19.
Även andra metoder har beskrivits för RNAi i fästingar 14, 33, beskrev injektion av dsRNA här är det mest använda i både unfed (tabell 1) och matas fästingar 16,25,34. RNAi har visat sig vara ett värdefullt verktyg för studier av fästingen geners funktion, karakteriseringen av tick-patogen gränssnitt och screening och karakterisering av fästing skyddande antigen 14,35. Framför allt har RNAi blivit den mest värdefullt verktyg för funktionella analyser i fästingar 35.
Metodiskt kommer RNAi utvecklas sannolikt till mer effektiva metoder som kan tillåta genen ÖVERVÄLDIGANDE i ett stort antal individer. Mekanismen för dsRNA-inducerad RNAi i fästingar bör förfinas för att bidra till en bättre förståelse och utnyttjande av denna genetiska tillvägagångssätt i denna art 35,36. Omfattningen av off-target effekter av RNAi i fästingar är också en viktig fråga som måste angripas fullt ut 14,27. Slutligen kommer RNAi sannolikt ge omfattande bidrag till studiet av fästingen genreglering och systembiologi och fästingen-patogen gränssnitt och kan ha en inverkan på utvecklingen av vacciner för att styra kryssa infestationer och överföring av fästingburna patogener.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar i våra laboratorier för givande diskussioner och tekniskt bistånd. Denna video presentation stöddes av Associate Dean för forskning och Institutionen för veterinärmedicinska Patobiologi, Centrum för veterinär Health Sciences, Oklahoma State University. Forskningen har finansierats av Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanien (projekt BFU2008-01244/BMC), den CSIC intramural projektet PA1002451 till JF, begåvad Walter R. Sitlington ordförande för livsmedel djurförsök till KMK, CVHS 2009 RAC bidrag, OAES djurhälsa Fonder och USDA, National Research Initiative Konkurrenskraftiga Grant, nr 2007 till 04.613.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Access RT-PCR system | Promega | A1250 | ||
Purelink PCR purification kit | Invitrogen | K3100-02 | ||
Megascript RNAi kit | Ambion | AM1626M | ||
Red dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72674 | ||
Plastic cups, 1.25 oz and lids | Solo Cup Company, Urbana Ill. | |||
Fine forceps | Electron Microscopy Sciences | Various | ||
Insulin syringe | Monoject | Fitted with a ½”, 29 gauge needle | ||
Hamilton syringe | Hamilton | 701SN,33/.375”/45DGR | Custom made | |
TriReagent | Sigma | 93289 | ||
iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green | Bio-Rad | 170-8892 | ||
Real-time PCR detection system | Bio-Rad | Several | Please refer to http://www.bio-rad.com/ |