Определение воздействия на Мутации BRCA1 гомологичной рекомбинации с использованием клеток, которые экспрессируют эндогенного дикого типа BRCA1

1. Клеточной линии с комплексной Субстрат Рекомбинация HeLa клетки стабильно трансформированные PDR-GFP (плазмиды 7 подарок от М. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) и поддерживается в пуромицин отбора трансформантов. Клетки пассировать в DMEM / FBS, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ GlutaMAX, 1 мМ пирувата натрия, пенициллина / стрептомицина (100 U / mL/0.1 мг / мл) и 1,5 мкг / мл пуромицин. Рекомбинации субстрата в PDR-GFP плазмиды, и в стабильных трансформантах, содержит два неактивных аллелей GFP (рис. 1). Один аллель неактивными из-за включения в его кодирующей последовательности из 18 б.п. рестриктазы сайт узнавания для I-SCEI. Выражение I-SCEI в этих клетках создает двухцепочечной ДНК брейк (DSB). Существует второй аллель неактивных GFP на этой ДНК, но часть ее последовательность коррелирует с I-SCEI сайт на первые аллель дикого типа. Это вторая аллель GFP может функционировать как последовательность доноров для гомологичной рекомбинации ремонт DSB и приведет к активным аллелем GFP, который легко обнаружить с помощью проточной цитометрии. Кроме того, DSB могут быть устранены путем негомологичных конечного присоединения, которая разрушила бы I-SCEI сайт рестрикции и приведет к GFP-отрицательные клетки. Уровень гомологичной рекомбинации в клетке определяется путем подсчета доли GFP-положительных клеток. Эта клеточная линия, pHeLa-DR13-9, был выбран среди всех клонов на нулевом фоне сигнала GFP и относительно высокий процент GFP-положительных клеток после трансфекции с I-SCEI выражения плазмиды, pCBASce. (PCBASce и его борьбы с переносчиками, pCAGGS, оба поставляются М. Jasin из Memorial Sloan-Kettering Cancer Center). HeLa-DR13-9 клеточной линии можно получить у авторов по запросу. 2. Трансфекция к разрушающим Эндогенные BRCA1 и Добавить Перейти Мутант BRCA1. Накануне первого трансфекции (как правило, вторник): Начните с 10 см блюдо HeLa-DR13-9 клетках не менее 90% вырожденная. Trypsinize в 1 мл и остановить реакцию добавлением 9 мл DMEM / FBS, хорошо перемешать с помощью пипетки. Добавить 40 мкл трипсинизировали клеток на лунку в 24-луночный планшет в 0,5 мл DME / FBS. День 1 трансфекции (среда): клетки должны быть ~ 40-50% вырожденным, если намного меньше начать все сначала. Трансфекции путем смешивания: 5 пмоль миРНК + 0,3 мкг BRCA1-мутант выражения плазмидной ДНК в 12,5 мкл Opti-MEM; и 0,5 мкл Lipofectamine 2000 года в 12,5 мкл Opti-MEM. Приступить к трансфекции в соответствии с протоколом Lipofectamine (Invitrogen). Замените СМИ 4-6 часов спустя. МиРНК мы используем, чтобы истощать BRCA1 основывается на последовательности GCUCCUCUCACUCUUCAGU указанием BRCA1 3'-UTR последовательности 80780 до 80798 (регистрационный номер AY273801). День 2: Трансфер клеток trypsinizing из 24-луночный планшет с 6 лунками. День 3 трансфекции: 25 пмоль миРНК + 0,75 мкг BRCA1-мутант выражения плазмидной ДНК + 0,75 мкг pCBASce (или pCAGGS векторное управление) в 62,5 мкл Opti-MEM и 2,5 мкл Lipofectamine 2000 года в 62,5 мкл Opti-MEM. Замените СМИ 4-6 часов спустя. 3. Анализ трансфектантов. На 6-й день, trypsinize клетки из каждой лунки и остановить в 1 мл DMEM / FBS. Анализ клеток для GFP выражение может быть сделано в дни, 5 или 7, но мы находим, что 6-й день работает лучше всего. Анализ 10 000 клеток на лунку с помощью проточной цитометрии. Мы используем Becton Dickinson FACSCalibur инструментом в государственном университете Огайо Всесторонний Онкологический центр аналитического ресурса цитометрии совместно. Событие на живые клетки закрытого использованием прямой и боковой параметров разброс. GFP-положительных клеток определяются с использованием детектора флуоресценции GFP (FL1), а результаты представлены в виде гистограммы (рис. 2, внизу). Остатки клетки могут быть replated для фотографии флуоресцентной микроскопии, при желании. 4. Представитель Результаты: BRCA1 регулирует пути для ремонта разрывов двухцепочечной ДНК с помощью гомологичной рекомбинации 6,11. Те клетки, которые прошли ремонт гомологичной рекомбинации легко обнаружить флуоресцентной микроскопии (рис. 2, вверху). Истощение BRCA1 приводит к снижению обнаружены GFP-положительных клеток (рис. 2, справа). Выход из FACSCalibur является гистограмма с GFP интенсивности на ячейку на оси Х и число клеток на оси ординат (рис. 2, внизу). В типичный набор результаты одного эксперимента, 15,5% клеток были GFP-положительных после I-SCEI выражения и контроля RNAi истощения (рис. 3). Для сравнения, истощение BRCA1 и векторных добавить обратно уменьшается GFP-преобразования до 0,7%. Дополнения назад дикого типа BRCA1 или BRCA1 (I21V) полностью восстановлено гомологичной рекомбинации, так как обнаружено, получая 15-16% GFP-положительных клеток. Дополнения задней BRCA1 (M18Т) мутант (рис. 3, дорожка 5) были же эффект, как надстройки задней переносчиками болезней. Так как этот вариант, высказанные на том же уровне, эндогенных белков 9, мы, таким образом интерпретировать BRCA1 (M18T) вариант неработоспособность гомологичной рекомбинации. Мы как правило, 10-20% клеток преобразовать в GFP-положительных после трансфекции I-SCEI выражение плазмиды. Истощение BRCA1 воспроизводимо снижает преобразования GFP-положительных клеток примерно 8-10 раз. Хотя фактический процент GFP-положительных клеток может меняться от эксперимента к эксперименту, отношение GFP-положительных клеток после BRCA1 истощение по сравнению с контролем истощения в эксперименте вполне последовательна. Мы нормализации результатов, установив раскованно преобразование частоты до 100% и выразить результаты с BRCA1 истощения и дополнения спиной в процентах. Таким образом, мы можем объединить несколько экспериментов, и экспериментальные изменения невелика. Добавить задней BRCA1 мутанты до сих пор дали надежные результаты: каждый BRCA1 вариант имеет либо полностью восстановлено гомологичной рекомбинации деятельности или имел никакого эффекта. Важным фактором в получении этих результатов является то, что наши условия трансфекции производить уровни BRCA1 белок, который примерно равные концентрации эндогенного белка в необработанных клетках. Слишком большое гиперэкспрессия даже дефектных мутантом BRCA1 могут привести к некоторым положительным гомологичной рекомбинации деятельности. Проблема, что нам необходимо было преодолеть токсичность трансфекции. Истощение BRCA1 сам может замедлить рост клеток, и баланс Lipofectamine 2000 года и плазмидной ДНК отношению к числу клеток на блюдо должны проводиться на стабильный уровень. Слишком много Lipofectamine или плазмидной ДНК приведет к сокращению числа клеток, и число ячеек будет недостаточно для получения достоверных результатов методом проточной цитометрии. Баланс плазмиды и Lipofectamine реагентов по сравнению с числом клеток, трансфицированных весьма важно для поддержания жизнеспособности клеток. Рисунок 1. Рекомбинации подложки. Стратегии, которая была разработана группой М. Jasin 7,12 изображен. PDR-GFP плазмида содержит двух дефектных аллелей GFP, один из которых содержит I-SCEI рестриктазы сайт. HeLa производные клеточной линии содержит этот субстрат ДНК интегрированы на одном месте в геноме 9, и активных ремонт двухцепочечной ДНК перерыв в I-SCEI сайта гомологичной рекомбинации приводит превращение одного аллеля GFP-положительных. Рисунок 2. Обнаружение GFP-положительных клеток путем флуоресцентной микроскопии. Клетки были протестированы в соответствии с этим протоколом, и контрольно-обедненного клетки были активны в гомологичной рекомбинации, так как обнаружены высокий процент клеток с GFP выражение (слева). Истощение BRCA1 по результатам RNAi в резком снижении числа GFP-положительных клеток (справа). Рисунок 3. Результаты дополнения назад мутантов BRCA1 миссенс. Результаты одного эксперимента представлены на этой гистограмме. При отсутствии трансфицированных I-SCEI выражения плазмиды (полоса 1) Есть не GFP-положительных клеток обнаружено. Результаты на дорожках 2-6 ​​были взяты из клетки, в которых я-SCEI выражения плазмиду трансфицированных на 3 день. В клетках, что были исчерпаны за не имеет значения гена (люциферазы) и с векторной надстройки назад, 15,5% от клетки GFP-положительных (дорожка 2). Истощение BRCA1 и векторных дополнения обратно показывает эффект потери BRCA1 на гомологичной рекомбинации (дорожка 3). Последствия истощения BRCA1 и дополнения назад дикого типа BRCA1 (дорожка 4), BRCA1 (M18T) (дорожка 5), и BRCA1 (I21V) (переулок 6), показано на рисунке. Эти результаты получены для одного эксперимента, и был бы в сочетании с по крайней мере еще два эксперименты повторить, чтобы получить меру гомологичной рекомбинации поддерживает данный мутантный белок BRCA1.