のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ</em

1。 赤痢アメーバのFCU負の選択システムベクトル制御ライン（HM1 / pKT3M）と実験ライン（HM1/pKT3M-FCU1）は、前述のテクニックの1,2により生成された。シードはT – 25フラスコにストックチューブから研究対象の行とTYI – S – 33 3培地で適切な抗生物質（12μg/ mlのG418）を追加することで選択を維持する。フラスコは37℃で成長の16〜18時間後に70から80パーセントコンフルエントになるはず℃に暖かいTYI – S – 33培地中で5 – フルオロシトシン（5 – FC、シグマ）の新鮮な50mmのストック溶液を準備します。完全に5 – FCを溶解するのに数分間、厳密に渦。 0.22μmのフィルターを通すことでストック溶液をろ過滅菌します。 3〜5分間氷上にフラスコを置き、室温で5分間200xgで遠心分離により細胞を収集することによって収穫のトロフォゾイト。新鮮TYI培地にペレットを再懸濁し、細胞を数えます。 典型的な実験のデザインは、1mLの最終容量で48ウェルプレートのウェル当たり0.5 × 10 4細胞を使用して、そして、各テスト条件のための三連を繰り返す。さらに、蛍光測定を容易にするために、別々のプレートは、1時点の各系統に使用されます。 各テスト5 – FCの濃度、三連のために、ウェルあたりの種子0.5 × 10 4細胞。 TYI培地中の抗生物質選択圧を維持する。今すぐ5 – FCのストック溶液を各ウェルにトロフォゾイトの必要量を追加します。 37℃で嫌気袋でプレートをインキュベート℃に 2。選択効率の決定 2 mgを/ DMSOでセルトラッカーグリーンCMFDA（Invitrogen社）のmlストック溶液を調製。ワーキングソリューションを作成するには、無血清TYI媒体の株式1000倍に希釈する。 栄養型培養プレートから完全に培養液を除去し、150μLの無血清TYI含むCMFDAと交換してください。 37℃インキュベーションを続ける℃で1時間。 井戸から染料溶液を除去し、Spectramax M2マイクロプレート光度計でプレートを読み取る。励起波長492nmで設定し、蛍光発光は517 nmで測定されるべきである。 テストのトランスフェク対コントロールの細胞の蛍光値を比較します。 各時間間隔でプレートの読み取りを続けます。各プレートに適切な正（TYIのみ）と負（25μg/ mLのハイグロマイシン）コントロールウェルを使用してください。 3。代表的な結果 E.赤痢のトランスフェクタントは、コドン最適化された組換えFCU1（図1）の強い発現を示した。このプロトコルはEの選択的除去では、結果が正しく実行されている場合赤痢は、細胞を0.5mMの5 -フルオロシトシンの存在下でFCU1を表現する。コントロール細胞は、対照的に5 – FCの5 mMの濃度までで正常に成長し、72および96時間（図2）との間でコンフルエントに達するために引き続き。処理された井戸が顕微鏡で観察しているときに48時間でFCU1持つ細胞が完全に溶解されています。これらはまた、サンプル（図2 – B）の多数を含む定量的な研究で使用されている生体染色色素CMFDA、で染色したときの蛍光の減少を示す。 FCU1/5-FCシステムはE.のための効果的かつ強力な負の選択ツールです。 赤痢はトロフォゾイト。 図1。 E.の世代負の選択マーカーを発現赤痢 HM1トランスフェク （A）FCU1組換えタンパク質は、抗c mycの抗体（上部パネル）を使用してウェスタンブロットで検出された。予想通り、42kDaバンドは、FCUのトランスフェクタントからではなく、コントロールのトランスフェベクター単独で合計ライセートに（矢印で示す）を検出することができた。下のパネルは同じブロットのローディングコントロールとして抗アクチン抗体でプローブを示しています。 （b）の定量的リアルタイムPCRの結果はlgl4コントロールに正規FCU1特定のmRNAの発現を示す。 図2 E.の in vitro薬剤感受性の負の選択マーカーを発現赤痢のトランスフェク （a）制御トランスフェクタントと（b）FCU1表現するトランスフェクタントは、48ウェルプレートで培養の生存曲線。細胞は濃度の増加の存在下で成長させたプロドラッグ5 – フルオロシトシン、X軸に示されるように、細胞の生存率は各時間間隔でCMFDA染色により定量した。 Y軸は蛍光の単位を表し、生き残った細胞集団を直接反映しています。 FCU1表現するトランスフェクタントは、コントロールと比較して0.5mmのプロドラッグの濃度で有意な感度を示したことに注意してください。セルがCOMとして、これらの井戸で120Hの時点で観察されなかった顕微鏡下で対応するコントロールウェル（データは示さず）に見られるようにコンフルエントに成長して比べ。 Hygroは、ネガティブコントロールとして使用される25μg/ mLのハイグロマイシンを表します。