Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

Existem dois métodos microinjeção-based que pode ser usado para medir a cinética de exportação mRNA em células de mamíferos; injeção de mRNA sintetizado in vitro, ou DNA plasmídeo, que é transcrito em mRNA in vivo. Cada técnica tem suas vantagens e desvantagens. Aqui nós descrevemos duas técnicas e discutir as diferenças entre as duas abordagens. 1. Preparação de materiais para injecção In vitro mRNA transcrito mRNA é transcrito a partir de qualquer plasmídeos ou produtos de PCR que contêm o gene de interesse upstream ladeado pelo promotor apropriado RNA polimerase (ie T7 SP6 ou promotores). Transcrição é realizada in vitro, utilizando a enzima adequada (T7 SP6 ou RNA polimerase, Invitrogen) com nucleotídeos adequados e analógica cap excesso. Transcrições são polyadenylated in vitro utilizando Poly-A-Polymerase (Invitrogen) e ATP de acordo com protocolos do fabricante. O mRNA é então purificado utilizando colunas de qualquer Invitrogen ou Qiagen. MRNA eluída são, então, precipitado pela adição de 1/20th volume de acetato de potássio 3M e 2 volumes de etanol 100% a -20 ° C durante uma hora seguida de centrifugação a 13.000 g a 4 ° C por 30min. Se o excesso de líquido está presente, o pellet pode ser lavado com etanol gelado 70%. O resultado mRNA pellet é seca ao ar, em seguida, solubilizadas em tampão de injeção (140mm KCl e HEPES 10mM, pH 7,4). Note que qualquer contaminante etanol pode ser tóxico para a célula de microinjeção. O mRNA solubilizados podem ser mantidos a -80 ° C para armazenamento de longo prazo. Para a microinjeção, mRNA é diluído em tampão de 200μg/ml de injeção e misturado com 488 Oregon Verde (GO) conjugado com 70kDa dextran (1mg/ml; Invitrogen). Desde o dextran OG-conjugado é muito grande para se difundem através do poro nuclear, que permitirá não apenas para identificar células injetadas, mas também ajudam a determinar o quanto do líquido foi injetado no núcleo e quanto vazou para o citoplasma ( ver 4.1.2). Alternativamente, qualquer fluorescentes, molécula de alto peso molecular que é incapaz de atravessar o poro nuclear pode ser usada. As amostras são centrifugadas a 13.000 g a 4 ° C durante pelo menos 20min antes de carregar a agulha, a fim de sedimentar qualquer matéria particulada que potencialmente podem obstruir a ponta da agulha. DNA plasmidial DNA plasmídeo contendo o gene de interesse pode ser preparado usando kits de purificação de DNA a partir de padrão Qiagen. Preparações DNA geralmente maiores tendem a ser de maior qualidade e, portanto, são transcritos de forma mais eficiente após a injeção. DNA do plasmídeo é diluída 50 a 200μg/ml em tampão injeção contendo OG-conjugados 70 kDa dextran (1mg/ml). Antes de carregar a agulha, o fluido de injeção é centrifugado a 13.000 g a 4 ° C durante pelo menos 20min. Agulhas para microinjeção Agulhas são fabricados a partir de 1,0 milímetros tubos de vidro de borosilicato capilar (item 1B100F-3; Mundial Precision Instruments Inc.), utilizando um Sutter p97 Flaming / Brown Micropipeta Puller com um filamento de 2,5 mm. As agulhas de injeção são gerados usando um programa de três etapas puxando usando uma caixa de filamento 2.5×4.5 mm (item # FB245B, Sutter Instrument Co.). Os parâmetros do programa utilizado neste experimento estão listados abaixo, porém eles devem ser otimizados para cada filamento. Etapa # Calor Puxe Velocidade Tempo Pressão 1 740 100 8 250 500 2 740 100 8 250 500 3 740 100 10 250 500 (Temperatura de rampa = 740) Preparação celular Geralmente qualquer linha de células de mamíferos podem ser microinjeção, entretanto tipos de células que são bem distribuídos tendem a ser mais passíveis de injeção. A escolha da linha celular pode também depender de outros fatores. Por exemplo, mRNAs que codificam para proteínas secretadas são direcionados para a superfície do retículo endoplasmático e isso é muito mais visível no COS-7, em comparação com células fibroblastos NIH 3T3 6 (compare a localização de t-FTZ-Δi mRNA nas figuras 3 e 4). As células devem ser semeadas em ácido lavado lamínulas quadrado (25x25mm) em petridishes 30 milímetros para pelo menos 24 horas antes da microinjeção. Em linhagens de células certas, espalhando-se podem ser estimulados por células de revestimento em fibronectina lamínulas revestido 6,8. Idealmente, a monocamada celular deve ser de aproximadamente 70-90% confluente no momento da injeção. Para permitir a fácil identificação de células injetadas, a monocamada de células é ferido antes da injeção usando uma ponteira 200μl de plástico. Geralmente ferida uma cruz (Figura 1) é gravado na lamela e as células são deixados para recuperar pelo menos 15min antes da injeção no tecido da cultura incubadora. Durante a microinjeção, os meios de cultura de tecidos lentamente perde CO 2 para a difusão e como resultado se torna alcalino. Para ajudar a manter um pH neutro durante a injeção, a mídia pode ser suplementado com HEPES 10mM pH 7.4. O buffer extra pode ser adicionada à mídia um dia antes de microinjeção. O Microscópio e micromanipulador Células são microinjeção usando um microscópio invertido que está isolado em uma mesa de ar para minimizar vibrações que pode ser prejudicial para o processo de microinjeção. O microscópio é equipado com dois objectivos, um pedaço seco de 10x, que é usado para posicionar as células ea agulha, e uma seca 40x extra longa trabalhando objetivo da fase à distância, que é usado para a imagem do processo de microinjeção. Aberrações ópticas causadas por células de visualização do outro lado da lamela e petridish pode ser eliminado se o objetivo tem um anel de correção. Assegurar que o microscópio de campo claro é devidamente alinhados para iluminação Köhler 9, também irá ajudar a corrigir aberrações causadas por luz sendo espalhados pela agulha de injeção (ver 2.2.4). A agulha é controlado por um dispositivo de micromanipulação de três eixos pendurado joystick (NT-88-V3MSH, Narishige). O manipulador grossa está garantido para o pilar de trás do microscópio para permitir que a agulha para ser facilmente levantados e abaixados no prato, mantendo a sua posição original. A agulha é presa a um bastão que é fixada ao manipulador grosseiro. Um tubo conecta a varinha para uma seringa de vidro 5cc (Item # 512311; Becton Dickinson), que gera a pressão de injeção necessária para ejetar líquido da ponta da agulha microinjeção. Para controlar o nível de pressão, a seringa e pistões são mantidos na posição por um regulador de seringa que consiste em duas rolhas, uma braçadeira para tubos (disponível em qualquer loja de ferragens) e dois grampos de metal (Figura 2). Para garantir que a seringa mantém a pressão alta, graxa de vácuo (Dow Corning) é aplicada ao êmbolo da seringa. A sonda de hibridização fluorescente A seqüência primária do ácido nucléico injetado é dobrado usando RNA software previsão secundário estrutura, tais como RNAstructure 4,6 10. As dobras mRNA são avaliados visualmente para identificar uma região de cerca de 50 nucleotídeos, que tende a ser livre de estruturas secundárias, com temperaturas de fusão elevado, como longas fitas duplas. O complemento reverso desta região é sintetizado com um fluoróforo Alexa546 ligado à extremidade 5 'da sonda (estes podem ser comprados a partir de Tecnologias Integradas DNA). A sonda é diluída com água a uma concentração de 100μM e é armazenado a -80 ° C por 2-3 anos. 2. Microinjeção intranucleares Carregando o fluido de injeção no microscópio microinjeção Cerca de 1μl de fluido de injeção é desenhada a partir do DNA da amostra centrifugada ou mRNA usandoGELoader dicas (Item # 022351656; Epindorff). Líquido deve ser aspirado a partir do topo da amostra para evitar a perturbação do sedimento que contém partículas que podem entupir a agulha. A ponta da pipeta é inserido na extremidade traseira da agulha eo líquido é ejetado. Líquidos serão atraídos para a ponta da agulha por ação capilar e um menisco perto da ponta devem ser visíveis dentro de 5-30seg. A agulha cheio de líquido é inserido no wand, que é fixada ao micromanipulador em um ângulo de 45 °. A agulha é visualizado com o objetivo de 10x e está posicionado no centro do plano de visualização perto do plano focal usando os botões micromanipulador grosseira. A agulha é, então, levantou alguns milímetros para evitar que sejam danificados em etapas posteriores (2.2.2) e então o pilar de volta microscópio é empurrado para trás. A pressão é maior, pressionando o êmbolo de 0,5 2cc. Microinjeção A petridish contendo uma tampa de deslizamento com uma monocamada ferido é colocado no palco de visualização. O pilar de volta microscópio é puxado para a frente para uma posição vertical, fazendo com que o condensador para ser alinhados ea agulha a entrar no líquido. Isto deve ser feito com cuidado para evitar quebrar a agulha para a lamela (ver 2.1.4). Usando a objetiva de 10x, o centro da ferida cruz é identificado ea agulha é posicionada acima das células a ser injetado. A ampliação é aumentada de mudar para a objetiva de 40x ea agulha é reduzido e centrado usando os botões de ajuste fino no joystick. Se a imagem estiver fora de foco, é preciso garantir que a luz incidente está alinhada corretamente (ie Kölher iluminação 9) usando uma lente de Bertrand (ver 1.5.2). Injecção deve começar em um canto da cruz de feridas e continuou ao longo de uma borda para facilitar a identificação de células injetadas durante a visualização (ver Figura 1). A agulha é reduzido para fazer contato com o núcleo. Pode-se dizer prontamente que uma célula foi injetada pela mudança notável na fase de brilho que acompanha a injeção. Se o fluido enche toda a célula pode indicar que a pressão está muito alta e precisa ser reduzida. Se nenhuma alteração no brilho de fase é detectada, isso pode indicar que tanto a microinjeção de pressão não é forte o suficiente para perfurar a membrana da célula, ou que a ponta da agulha está obstruída. Este pode ser o resultado de uma série de questões, incluindo: pressão insuficiente, imperfeições na agulha, e bloqueio da ponta da agulha com partículas pequenas. Uma vez que o carregamento de cada agulha no micromanipulador é demorado, e uma vez que o substrato de injeção é freqüentemente muito valioso, é importante para maximizar a percentagem de agulhas que pode ser efetivamente usado para injectáveis. Abaixo está um passo-a-passo para tentar desbloquear uma ponta de agulha entupida. Após cada etapa, deve-se tentar injetar 2-3cells para avaliar se a obstrução foi removido: Ação Finalidade e Objetivo 1 Ajustar o foco para ver o comprimento da ponta da agulha. Para determinar se existe uma imperfeição óbvia na agulha ou se existe um grande pedaço de partículas bloqueio da ponta. 2 Coloque a ponta da agulha ao lado de um pedaço flutuante de partículas no prato. Se o líquido estiver saindo da ponta deve agitar a partícula sem ele entrar em contato direto com a agulha. 3 O êmbolo até o fim da seringa Este aumento temporário da pressão deve limpar qualquer obstrução na ponta. Após a liberação do êmbolo, deve subir por conta própria, se isso não acontecer, significa que essa pressão não está sendo construída na seringa e você precisa apertar as conexões e / ou adicionar a graxa de vácuo adicional. 4 Levante a agulha para fora da célula media A força do desenho a agulha do meio aquoso pode ajudar a desalojar as obstruções na ponta da agulha. 5 Retire o êmbolo da seringa completamente e reinseri-lo. Esse aumento adicional na pressão pode ser obrigado a limpar a ponta da agulha. 6 Arranhar a ponta da agulha em uma parte limpa da lamela Este ainda agita as partículas dentro da agulha e ajuda a reposicioná-la para aliviar a obstrução na ponta. Mais forte pode arranhar chip de fora da extremidade da ponta, permitindo a obstrução para sair da agulha. 7 Carregar uma nova agulha Outro problema comum é a perda gradual de pressão dentro da agulha, exigindo uma indemnização pelos mais freqüentes pressionando o êmbolo da seringa. Muitas vezes, a adição de gordura a vácuo adicionais para o êmbolo da seringa pode ajudar a manter a pressão mais consistente. No entanto, este problema pode ser devido a vazamentos de conexões entre seringa e tubo, o tubo eo wand, ou a varinha ea agulha. A maioria dos vazamentos de ar podem ser seladas com Parafilm (Fisher) ou graxa, se necessário, apesar de vazamentos entre a varinha e agulha só pode ser corrigido alterando a junta de borracha na varinha. Células ao longo de uma borda da ferida são microinjeção ao longo da borda da ferida por um período fixo de tempo (10-15min). Com a prática várias centenas de células pode ser injetado durante este intervalo. Após a microinjeção, as células são incubadas a 37 ° C em uma incubadora para cultura de tecidos a quantidade desejada de tempo antes da fixação. Se injetar DNA, a transcrição é terminado depois de 20min por tratar células com α-amanitina (1μg/ml; Sigma-Aldrich) dissolvido em meio de crescimento. Esta concentração efetivamente inibe a transcrição de plasmídeo microinjeção (Figura 3). A única agulha pode ser reutilizado para injetar lamínulas múltiplas, embora a agulha deve ser substituída quando se muda o tipo de DNA ou RNA que é microinjeção. Uma vez que a agulha é removida da varinha é deve ser descartado e não reutilizado. Células mortas ou flutuante, ocasionalmente, ficar com a ponta da agulha e pode interferir com microinjeção. Para remover os entulhos da agulha, levante a agulha para fora do líquido, empurrando para trás o pilar e depois, lentamente, reinsira a agulha no líquido reajustando o pilar para a posição vertical. Para obter uma medida precisa do nuclear medição exportação mRNA cinética, amostras separadas deve ser fixada em 0min, 15min, 30min, 60min e 120min microinjeção pós-RNA, ou depois de α-amanitina tratamento. 3. Fixação de células e de coloração Fixação de células e permeabilização No momento oportuno, os meios de crescimento é aspirado e as células são lavadas duas vezes com 2 ml solução de PBS (NaCl 137mm, 2,7 KCl, 10mM Na 2 HPO 4, 2mM KH 2 PO 4, pH 7,4). É importante manter as lamelas úmido, minimizando o tempo que eles não estão submersos em líquido. As células são fixadas pela adição de 2ml de paraformaldeído 4% (Ciências Microscópio Eletrônico) em PBS por pelo menos 15min em temperatura ambiente. As amostras fixas são lavadas duas vezes com solução PBS. As células são permeabilizadas com 2ml de 0,1% Triton X-100 em PBS por pelo menos 15 minutos em temperatura ambiente. As amostras são lavadas duas vezes com solução PBS. Coloração FISH Em seguida as amostras precisam estar preparados para a hibridização. As células são lavadas duas vezes com solução SSC 1x (150mm NaCl, citrato de sódio 15mM, pH 7,0) com formimide 25-60%. Para a quantidade de formamida, use a mesma concentração que está presente na solução de hibridização (ver 3.2.3). Para preparar a câmara de coloração, o fundo de um petridish 150 milímetros é coberta com água e um pedaço de Parafilm é flutuavam na água. A água é removida girando o prato mais, permitindo assim que o Parafilm para aderir ao fundo do prato. Bolhas de ar são manualmente removido. Para cada lamela a ser manchado, gotas 100μl da solução de hibridação (25-60% formamida, 100mg/ml sulfato de dextrano, 1mg/ml E. coli tRNA, complexo riboside 5mM de vanádio em 1x SSC com sonda diluída 1:500) são pipetados sobre o parafilme. Note-se que a quantidade de formamida deve ser otimizado para a sonda de FISH especial a ser utilizado. Com a ajuda de uma pinça, uma lamela é removido de um petridish 30mm, em seguida, usando filtro de papel Whatman (VWR) a parte de trás (livre de células lado) da lamela é buffer de secas e excesso é mau do lado da frente sem secar o fixo células. A lamínula é colocada de bruços sobre a solução de FISH. Isto é repetido para cada lamela. Depois de colocar a tampa do compartimento coloração de volta, as amostras são incubadas por 5-18hrs a 37 ° C. Lavagem e Montagem do Amostras Stained Câmaras de lavagem são feitas diversas da mesma forma como a câmara de coloração (ver 3.2.2). Para cada lamela, 1 ml de tampão de lavagem (1x SCC com formamida 25-60%) é pipetado para o parafilme da câmara de lavagem. Mais uma vez, use a mesma concentração de formamida que está presente na solução de hibridização (ver 3.2.3). Para remover as lamelas da câmara de coloração, 1ml de tampão de lavagem é pipetado ao lado da lamela. O líquido deve ser elaborado sob cada amostra por ação capilar. Utilizando uma pinça, as lamelas são removidos e cada um é colocado sobre a queda de tampão de lavagem e incubadas em temperatura ambiente por 5 min. Passos 3.3.2 a 3.3.4 são repetidas mais duas vezes, de modo que cada lamela é lavado com um total de 3 vezes. Se o RNA é ser costained com alguma proteína por imunofluorescência, ver secção 3.4. Slides são lavados com etanol 70%, e secos com Kimwipes. Para cada lamela, 10-30 mL de solução de montagem com DAPI (Fluoromount G, Southern Biotech) é pipetado para os slides. Cada slide pode acomodar duas lamelas. Utilizando uma pinça e papel de filtro Whatman, a parte de trás do lamínulas é seco e excesso de líquido é mau fora da parte da frente da lamela sem secar as amostras. Cada lamela é então colocada virada para baixo, para a gota de solução de montagem. Amostras pode ser montada loja a 4 ° C. A coloração de imunofluorescência As amostras devem ser lavadas duas vezes com PBS para remover formamida que pode interferir com a coloração de anticorpos adequado. Para cada lamela, 50μl da solução de anticorpo primário (anticorpo 1.0μg/ml, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml RNAse-free BSA em PBS) é pipetado para o parafilme de uma câmara de lavagem. Utilizando uma pinça, as lamínulas são colocados lado célula para baixo para a solução de anticorpo primário e permitiu a incubar a temperatura ambiente por 30min. Para cada lamela, duas gotas 1ml de PBS são pipetados para o parafilme de uma câmara de lavagem. Para remover as lamelas da solução de coloração de anticorpos, 1 ml de PBS é pipetado ao lado da lamela. O líquido deve ser elaborado sob cada amostra por ação capilar. Utilizando uma pinça, as lamelas são removidos e cada um é colocado na primeira gota de PBS por 5min e depois colocados na segunda gota de PBS por mais 5min. Passos 3.4.2 a 3.4.6 são repetidas usando a solução de anticorpo fluorescente secundário (anticorpo 1.0μg/ml, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml BSA em PBS). Note que desde que o marcador de injeção e RNA são visíveis no canal verde e vermelho, o anticorpo secundário deve ser conjugada a um corante compatível, como Alexa647. Lamínulas são montados como em 3.3.7. 4. Imagem e Quantificação Imagem Um microscópio de epifluorescência, é usado para a imagem das células após a injecção. Células injetadas podem ser localizados por localizar as feridas cruz e identificação de células com marcador injetada (OG-dextran). Para cada célula observada, uma imagem da injecção de OG-dextran é adquirido. Quando imagem microinjeção mRNA é importante que a quantificação é limitada às células que receberam> 90% do líquido injetado (ou seja, dextran) para o núcleo. Uma imagem do RNA é então adquirido. Para permitir a medição precisa da RNA, o tempo de exposição entre todas as células dentro de um curso de tempo deve permanecer constante e cair dentro da faixa dinâmica da câmera. Idealmente, cada imagem deve incluir uma célula uninjected para ser capaz de calcular o próprio fundo de fluorescência intensity (ver 4.2.4). Para ajudar na quantificação, uma imagem do DAPI mancha também pode ser adquirido. Além disso, se imunofluorescência foi realizada, a proteína também pode ser manchada com imagens. Um exemplo de distribuição de mRNA em vários pontos em um curso de tempo é mostrado na Figura 4. O mRNA codifica uma proteína secretada e, portanto, voltado para o ER no COS-7 células. Note que a ER-alvo foi verificada por co-coloração da RNA com anticorpos contra TRAPα, uma proteína ER residente 11. Quantificação Isso pode ser feito com um número de diferentes pacotes de software de análise de imagem. ImageJ software é adequado para quantificar a distribuição de mRNA celular, uma vez que pode ser usado para separar manualmente frações nuclear e citoplasmática, ele pode medir a fluorescência média dessas frações, e os dados de sua saída pode ser facilmente copiado e colado em outro software, como Microsoft Excel. Imagens correspondentes a pescar, OG-dextran, e fluorescência DAPI são abertos e mescladas usando o Imagens para Stack ferramenta. Em ambos os DAPI ou camada dextran a ferramenta Threshold é usado para isolar a área correspondente ao núcleo microinjeção. Esta fração é selecionado usando a ferramenta Varinha, e depois de se mudar para a camada de FISH, a área (A Nuc) e média / média intensidade (F Nuc) são gravadas utilizando a ferramenta de Medida. O perímetro da célula é descrito usando a ferramenta de seleção Freehand, e ao mesmo tempo sobre a camada de FISH a área (A Tot) e média / média intensidade (F Tot) são gravadas utilizando a ferramenta de Medida. Se o seu celular de fluorescência é significativamente mais intenso do que a do fundo, você pode usar a ferramenta Threshold, em vez de a ferramenta de seleção Freehand para delinear o seu celular desejado. Usando a função de seleção retangular, uma caixa é desenhada sobre uma célula uninjected ea intensidade média / média (F Back) é registrado. Todas as medidas são copiados para uma planilha excel. MRNA exportados é calculada utilizando a seguinte equação: A Nuc Área do núcleo A Tot Área da célula inteira F Nuc Fluorescência média da fração nuclear F Tot Fluorescência média da fração de células inteiras F Voltar Fluorescência média de uma célula untransfected Para cada ponto o tempo médio é de Exportação% calculados e plotados ao longo do tempo. Estabilidade do mRNA é calculado traçando a fluorescência mRNA média total (A x Tot (F Tot – F Back)) ao longo do tempo. Normalmente encontramos essa quantidade de mRNA varia muito entre as células e entre lamínulas. Isto pode ser devido a inconsistências entre as taxas de fluxo de agulha e entre a eficiência de coloração FISH. Figura 1. Células lamela microinjeção. Crescem até que sejam confluentes 70-90%, em seguida, ferido verticalmente e horizontalmente usando uma ponteira 200μl de plástico. A partir da cruz-ferida, as células são injetadas em uma borda da ferida (seta). Figura 2. Regulador de Seringa. A) Diagrama demonstrando a forma como o regulador de seringa é montado. B) Esquema do aparelho montado. C) Uma fotografia do regulador seringa montadas. Figura 3. Efeitos da α-amanitina na transcrição de DNA plasmídeo injetado. NIH3T3 células fibroblasto, que foram pré-tratados com diferentes concentraçõess de α-amanitina, foram injetados com t-FTZ-Δi DNA plasmidial e OG-conjugados 70kD dextran. Células injetadas foram incubados a 37 ° C por 1 hora e, em seguida, fixadas e coradas para t-FTZ-Δi mRNA usando um FISH específicas probe6. Cada linha corresponde a um único campo de visão com imagens de OG-70kDa dextran e t-FTZ-Δi mRNA. Note-se que altos, mas não baixa, as concentrações de droga inibiu completamente a produção de t-FTZ-Δi transcrição. Barra de escala = 15μm. Figura 4. Curso de tempo da exportação mRNA nuclear. COS-7 células foram injetadas com t-FTZ-Δi DNA plasmidial e OG-conjugados 70kD dextran. 30min após a injecção de células foram tratadas com α-amanitina e incubados a 37 ° C para os pontos de tempo indicado. As células foram então fixadas e coradas com sonda contra a t-FTZ-Δi mRNA e com anticorpos contra o marcador ER TRAPα. Cada linha corresponde a um único campo de células. A) distribuição de mRNA após uma timecourse microinjeção. B) Um golpe até do ponto de tempo de 120min (A) demonstrando a co-localização de t-FTZ-Δi mRNA e da ER. Uma sobreposição do mRNA t-FTZ-Δi (verde) e coloração TRAPα (vermelho) é mostrado no painel direito. Barra de escala = 15μm.