マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

in vitroで合成されたmRNA、またはmRNAへの生体内で転写されるプラスミドDNAの注入、哺乳類細胞でのmRNA輸送の動態を測定するために使用できる2つのマイクロインジェクションベースの方法があります。各テクニックは、その利点と欠点があります。ここでは、両方のテクニックを説明し、2つの方法の違いを議論する。 1。注射のための材料の準備 in vitroで転写されたmRNA の mRNAは、プラスミドまたは適切なRNAポリメラーゼのプロモーター（すなわち、T7またはSP6プロモーター）によって上流に挟まれた目的の遺伝子を含むPCR産物のいずれかから転写される。転写は、適切なヌクレオチドと過剰キャップアナログで適切な酵素（T7またはSP6 RNAポリメラーゼ、Invitrogen）を用いてin vitroで行われます。 転写産物は、製造元のプロトコールに従ってポリ- A -ポリメラーゼ（Invitrogen社）とATPを用いてインビトロでポリアデニル化されています。 mRNAはその後、Invitrogen社やキアゲンのいずれかから列を使用して精製される。 溶出されたmRNAはその後、30分間4℃で13,000 gで遠心分離° Cに続く1時間20分の1量の3M酢酸カリウム、-20 ° Cで1​​00％の2容量のエタノールを加えて沈殿されています。過剰の液体が存在する場合、ペレットを氷冷70％エタノールで洗浄することができる。 得られたmRNAペレットは、空気がその後インジェクションバッファー（140mmのKClと10mMのHEPES緩衝液、pH7.4）で可溶化乾燥です。あらゆる汚染物質エタノールはマイクロインジェクション、細胞への毒性があることに注意してください。可溶化されたmRNAは、-80℃で長期保存のために保持することができます。 マイクロインジェクションのために、mRNAをインジェクションバッファーで200μg/mlに希釈され、オレゴングリーン488（OG）標識70kDaデキストラン（1mg/ml;インビトロジェン社）と混合。 OG -共役デキストランが核膜孔を介して拡散するには大きすぎるので、それは注入された細胞を同定するだけでなく、核内に注入し、どの程度の細胞質に漏出した液量の決定に役立つためにだけではなくが有効になります（ ）4.1.2を参照してください。また、核膜孔を通過することができない任意の蛍光、高分子量の分子を使用することができます。 サンプルは、潜在的に針の先端の妨げになるペレット任意の粒子状物質の順に針をロードする前に少なくとも20分のために4℃で13,000 gで遠心分離されています。 プラスミドDNA 目的の遺伝子を含むプラスミドDNAはキアゲンから標準的なDNA精製キットを用いて調製することができる。一般的に大規模なDNA調製物は、より高い品質のものになる傾向があり、より効率的に注入した後に転写される。 プラスミドDNAは、OG -共役70kDaのデキストラン（1mg/ml）を含有する注射剤の緩衝液で200μg/mlに50を希釈している。 前に針をロードするために、注射液は、少なくとも20分のために4℃で13,000 gで遠心分離する。 マイクロインジェクション用の針 2.5ミリメートルフィラメントでサッタp97のフレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーを使用して、針が1.0ミリメートルホウケイ酸ガラス毛細管（世界プレシジョンインスツル株式会社商品番号1B100F – 3）から製造される。 注射針は2.5×4.5 mmのボックスのフィラメント（項目＃FB245B、サッターインストゥルメント社）を用いてプログラムを引っ張って三段階を使用して生成されます。この実験で使用したプログラムのパラメータを以下にリストされている、しかし、彼らはそれぞれのフィラメントのために最適化する必要があります。 ＃ステップ 熱 プル 速度 タイム 圧 1 740 100 8 250 500 2 740 100 8 250 500 3 740 100 10 250 500 （ランプの温度= 740） 細胞の準備一般的に任意の哺乳動物細胞株を微量注入することができます、しかしよく分散している細胞の種類は、注入により従順になる傾向があります。細胞株の選択は、他の要因に依存するかもしれません。例えば、分泌タンパク質のコードは、小胞体の表面を標的と、これははるかに目に見えるCOS – 7細胞になるされていることをmRNAには、NIH 3T3繊維芽細胞に比べ6（図3のtは- ftz -ΔIのmRNAの局在を比較すると4）。 細胞は、マイクロインジェクションには少なくとも24時間前のための30ミリメートルpetridishesにおける酸洗浄の正方形カバーグラス（25x25mm）に播種してください。特定の細胞株では、拡散はフィブロネクチンコーティングされたカバースリップ6,8上にめっき細胞によって刺激することができる。理想的には細胞の単層は、注入の時におよそ70から90パーセントコンフルエントにする必要があります。 注入された細胞を容易に識別できるようにするには、細胞単層を200μlのプラスチック製のピペットチップを使用して注射前に負傷しています。一般的にクロス巻き（図1）カバースリップにエッチングされ、細胞を組織培養インキュベーター内注射に少なくとも15分前で回復に委ねられている。 マイクロインジェクションの間に、組織培養培地は、徐々に拡散するCO 2を失い、その結果は、アルカリになるように。注射時のpHが中性を維持するために、メディアは、10mMのHEPES pH7.4で補足することができます。余分なバッファがメディアマイクロインジェクションの前日に追加することができます。 顕微鏡とマニピュレーター細胞は、マイクロインジェクションのプロセスに悪影響を与える可能性がある振動を最小限に抑えるために空気のテーブルに分離されている倒立顕微鏡を使用してマイクロインジェクションしている。顕微鏡は、二つの目標が装備され、細胞と針を配置するために使用される乾燥した10xの作品、そして画像マイクロインジェクションのプロセスをするために使用される乾燥した40倍速の余分な長作動距離段階の目標を、。 目的は、補正環を持っている場合、カバーとペトリ皿全体に表示するセルによる光学収差を排除することができます。顕微鏡の視野が適切にケーラー照明9にアラインメントされていることを確認し、また、注射針（2.2.4を参照）によって散乱される光によって生じる収差を適切に役立ちます。 針は、3軸吊りジョイスティックのマイクロマニピュレーション装置（NT – 88 – V3MSH、ナリシゲ）によって制御されます。粗マニピュレーターは元の位置を保持しながら針を容易に皿に昇降できるようにするために顕微鏡の後ろの柱に固定されている。 針は、粗マニピュレーターにクランプされているワンドに固定されている。マイクロインジェクションの針の先端から液体を排出するために必要な射出圧力を生成する、、チューブは、5ccのガラスシリンジ（Becton Dickinson社製商品番号512311）に杖を接続します。圧力レベルを制御するには、シリンジバレルとピストンは2つのストッパー、パイプクランプ（任意のハードウェア店で入手可能）と2つの金属クランプ（図2）から構成されるシリンジのレギュレータによって位置に保持されています。注射器は、高圧を維持することを保証するために、真空グリース（ダウコーニングは）シリンジのプランジャーに適用されます。 蛍光ハイブリダイゼーションプローブ注入された核酸の一次配列は、そのようなRNAstructure 4.6 10のようなRNA二次構造予測ソフトウェアを、使用して折り畳まれる。 mRNAの折畳は視覚的にそのような長い二本鎖として高い融解温度を持つ二次構造の自由になる傾向がある約50のヌクレオチドの領域を識別するために評価されています。 この地域の逆相補は、プローブの5'末端に接​​続されているAlexa546蛍光体で合成される（これらは、統合されたDNA Technologiesから購入することができます）。 プローブは、100μMの濃度に水で希釈し、2〜3年-80 ° Cで保存されます。 2。核マイクロインジェクションマイクロインジェクションの顕微鏡で注射液のロード注射液の約1μlのは、使用して遠心分離したDNAまたはmRNA試料から描かれていますGELoaderのヒント（商品番号022351656; Epindorff）。液体が針を詰まらせることができる粒子状物質を含むペレットを中断することを避けるために、サンプルの上部から吸引してください。 ピペットの先端が針のバックエンドに挿入され、液体が排出されます。液体は毛管現象によって針の先端に描画され、先端近くにメニスカスは、5 30秒以内に表示されるはずです。 液体で満たされた針は、45 °の角度でマイクロマニピュレータにクランプされるワンド、挿入されます。 針は10倍を目的とした可視化と粗マイクロマニピュレータのノブを使用して焦点面の近くに表示平面の中央に配置されている。針は、後のステップでダメージを受けるのを防ぐために数ミリメートルを向上させています（2.2.2）してから、顕微鏡のバックの柱は押し戻されている。 圧力は、プランジャー0.5 – 2ccのを押すことによって増加します。 マイクロインジェクション負傷した単分子膜でカバースリップを含むペトリ皿を表示するステージ上に配置されています。 顕微鏡のバックの柱が整列するコンデンサー、液体を入力して針を引き起こして、直立する位置まで前方に引っ張られている。これは、（2.1.4を参照）、カバースリップの上に壊すから針を防ぐために慎重に行う必要があります。 10倍対物レンズを用いて、クロス傷の中心地が特定され、針が注入されるようにセルの上に配置されている。 倍率は40倍の目標に切り替えて、針がジョイスティックで微調整ノブを使用して低下し、中心に増加しています。画像の焦点が合っている場合は、1つは、（1.5.2を参照）ベルトランレンズを使用して（すなわちKölher照明9）入射光が適切に配置されていることを確認する必要があります。 注入は、創傷クロスの一角から始まり、可視化の間に注入された細胞（図1参照）の識別を容易にするために片方の端に沿って続けてください。 針は、核に接触するまで下げています。一つは、容易に細胞が注入を伴う位相の明るさに顕著な変化が注入されていることを伝えることができます。 流体がセル全体をいっぱいにした場合、それは圧力が高すぎると低下する必要があることを示している可能性があります。 相の明るさに変化が検出されない場合、これはどちらマイクロインジェクションの圧力が貫通する細胞膜に十分な強さではないこと、または針の先端が詰まっていないことを示すことがあります。不十分な圧力、ニードルの不完全性、および小さな粒子状物質と針の先端の閉塞：これは、など、多くの問題の結果である可能性があります。マイクロマニピュレータに各針を読み込むので時間がかかり、そして注入基板は多くの場合非常に貴重であるので、それが効果的に注射のために使用できる針の割合を最大化するために重要です。以下のステップバイステップガイド詰まった針の先端のブロックを解除しようとしているためです。各ステップの後で、一つは障害物が除去されたかどうかを評価するために2 – 3セルを注入するようにしてください。 処置 目的と目標 1 針先の長さを表示するには、フォーカスを調整する。 針や先端を遮断する微粒子の大部分があるかどうかを明らかに欠陥があるかどうかを判断する。 2 皿の微粒子の浮遊部分の横に針の先端を置きます。 流体が先端を終了している場合、それは針に直接接触することなく粒子を撹拌してください。 3 注射器の非常に最後にプランジャーを押し下げ圧力のこの一時的な増加は、先端に障害物をクリアする必要があります。プランジ​​ャーを解放した後、それは自発的に上昇する必要があります。そうでない場合は、この手段の圧力は、注射器で、構築し、接続部分を締めて下さいおよび/または追加の真空グリースを追加する必要がありますされていません。 4 セルMEDの外針を上げるIA 水性媒体の中から針を描くの力は、針の先端に障害物を取り除くことができます。 5 完全にシリンジからプランジャーを取り外して装着しなおします。 圧力のこの追加の増加は、針の先端をクリアするために必要となる場合があります。 6 カバースリップのクリーンな部分に針先を傷つけないこれにより、さらに針内に微粒子を攪拌し、先端の閉塞を軽減するためにそれを再配置することができます。強い傷は針を終了するには閉塞を可能にする、チップの先端オフチップがあります。 7 新しいニードルをロードする別の一般的な問題は、さらに注射器のプランジャーを押し下げて、頻繁な補償を必要とする、針内の圧力が徐々に失わです。多くの場合、シリンジのプランジャーに追加の真空グリースを追加すると、より一貫した圧力を維持するのに役立ちます。しかしこの問題は、リークシリンジやチューブ、チューブやワンド、またはワンドと針の間の接続が原因である可能性があります。ワンドと針の間にリークが唯一のワンドにゴムパッキンを変更することにより訂正することができますが、ほとんどの空気漏れは、パラフィルム（フィッシャー）または必要に応じてグリースを使用してシールすることができる。 傷の縁に沿って細胞が一定時間（10〜15分）のために傷の端に沿ってマイクロインジェクションされています。実際、数百人の細胞は、このインターバルの間に注入することができる。 マイクロインジェクション後、細胞を37℃でインキュベートされています°固定前に時間の所望の量のための組織培養インキュベーター内C。増殖培地中に溶解し、DNAを注入した場合、転写は、α-アマニチン（Sigma – Aldrich社1μg/mlの）で細胞を処理することにより、20分後に終了します。この濃度では効果的に（図3）マイクロインジェクションプラスミドからの転写を阻害する。 針がするときに一変更微量注入されたDNAまたはRNAの種類を交換する必要があるものの、単一の針は、複数のカバースリップを注入するために再利用することができます。いったん針がワンド処分と再利用されるべきさから削除されます。 デッドオア浮遊細胞は、時折、針の先端に付着し、微量注入の妨げになることがあります。針からこのゴミを削除するには、柱を押し返すことによって液体から針を上げ、その後徐々に直立の位置に柱を再調整することによって戻って液体に針を挿入してください。 mRNAの核外輸送反応速度の測定の正確な測定を得るために、別々のサンプルは、0分に固定されるべきである15分、30分、60分および120分後のRNAのマイクロインジェクション、またはα-アマニチン治療後。 3。細胞の固定と染色細胞の固定と透過処理適切な時期に、増殖培地を吸引し、細胞を2 mlのPBS溶液（137mMのNaCl、KClの径2.7mm、10mmののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4、pH7.4）で2回洗浄する。それらは液体に浸漬されていない時間を最小限に抑えることにより、カバースリップが湿った状態にしておくことが重要です。 細胞は室温で少なくとも15分間PBS中4％パラホルムアルデヒド（電子顕微鏡の科学）の2ミリリットルを追加することで解決されています。 固定試料は、PBS溶液で2回洗浄する。 細胞は室温で少なくとも15分間0.1％トリトンの2ミリリットルX – 100 PBSで透過化されています。 サンプルは、PBS溶液で2回洗浄する。 FISH染色次に、サンプルは、ハイブリダイゼーションのために準備する必要があります。細胞は25から60パーセントのformimideと1X SSC溶液（150MMのNaCl、15mmのクエン酸ナトリウム、pH7.0）で2回洗浄する。ホルムアミドの量については、（3.2.3を参照）ハイブリダイゼーション溶液中に存在する同一の濃度を使用してください。 染色槽を準備するには150mmペトリ皿の底が水で覆われており、パラフィルムの一部が水に浮いている。水はパラフィルムが皿の底に付着させるので、皿を上に回して削除されます。気泡は、手動で再されています移動。 各カバースリップステンドようにするには、ハイブリダイゼーション溶液（25〜60パーセントのホルムアミド、100mg/mlデキストラン硫酸、1mg/ml 大腸菌tRNA、1:500に希釈したプローブを用いた1 × SSCで5mMのバナジルリボシド複合体）の100μlの滴をピペットで取りされていますパラフィルム上に。ホルムアミドの量が使用されて特定のFISHプローブ用に最適化されるべきであることに注意してください。 鉗子の助けを借りて、カバースリップは、固定を乾燥させずに、フロント側から邪悪ワットマンろ紙（VWR）カバーの背面側（無細胞側）乾燥と過剰バッファがあるしている使用して、30ミリメートルペトリ皿から削除されます細胞。カバースリップは、FISHのソリューションの上に顔を下に配置されます。これは、各カバースリップのために繰り返されます。 に戻って染色チャンバーの蓋を配置した後、試料を37℃で5 – 18hrsインキュベートする染色サンプルを洗浄し、マウントいくつかの洗浄室は、染色槽（3.2.2を参照）と同じ方法で作られています。 それぞれのカバーのために、洗浄バッファー（25から60パーセントのホルムアミドと1X SCC）の1mlを、洗浄槽のパラフィルムの上にピペッティングします。再び、（3.2.3を参照）ハイブリダイゼーション溶液中に存在するホルムアミドの同じ濃度を使用してください。 染色槽からカバースリップを削除するには、洗浄緩衝液1mlのは、カバースリップの隣にピペットで入れる。液体は毛管現象によって、各サンプルの下に描画されるべきである。 鉗子を使用して、カバースリップが削除され、それぞれは、洗浄用緩衝液の滴の上に配置され、5分間室温でインキュベート。 3.3.2に3.3.4の手順は、それぞれのカバーが3回の合計を洗浄されるように、さらに2回繰り返されます。 RNAは、免疫蛍光法により、いくつかのタンパク質とcostainedする場合は、セクション3.4を参照してください。 スライドを70％エタノールで洗浄し、キムワイプで乾燥されています。それぞれのカバーのために、DAPI（Fluoromount G、南部バイオテク）で解決策をマウントの10〜30μlをスライド上にピペットで入れる。各スライドには2つのカバースリップを収容することができます。 鉗子とワットマン濾紙を使用して、カバースリップの後ろは乾燥させ、過剰の液体は、試料を乾燥させずにカバーの前面側から邪悪です。各カバーは、取り付け溶液の液滴の上に、顔を下に配置されます。 マウントされているサンプルは4℃で保管することができます℃の免疫蛍光染色サンプルは、適切な抗体の染色を妨げる可能ホルムアミドを除去するために、PBSで2回洗浄する必要があります。 それぞれのカバーの場合は、一次抗体溶液（1.0μg/ml抗体、0.1％TX – 100、PBSで0.1mg/mlのRNase – free BSA）50μlのは、洗濯槽のパラフィルムの上にピペッティングします。 鉗子を使用して、カバースリップは、一次抗体溶液に細胞の側を下に配置し、30分間室温でインキュベートされている。 それぞれのカバーの場合は、PBSの二つ1ミリリットル滴は、洗濯室のパラフィルムの上にピペットでされています。 抗体染色液からカバースリップを削除するには、PBSを1mlはカバースリップの隣にピペットで入れる。液体は毛管現象によって、各サンプルの下に描画されるべきである。 鉗子を使用して、カバースリップが削除され、それぞれが5分のためのPBSの最初のドロップの上に配置され、その後、別の5分間のPBSの第二ドロップの上に置く。 3.4.6へのステップ3.4.2は蛍光二次抗体溶液（1.0μg/ml抗体、0.1％TX – 100、PBSで0.1mg/ml BSA）を用いて繰り返される。注射のマーカーとRNAが緑と赤のチャンネルに表示されているので、二次抗体などAlexa647などの互換性のある色素とコンジュゲートであることに注意してください。 カバースリップは、3.3.7のようにマウントされます。 4。イメージングと定量化イメージング落射蛍光顕微鏡は、画像注射後の細胞をするために使用されます。注入された細胞は、クロスの傷を配置し、注入されたマーカー（OG -デキストラン）を持つ細胞を識別することによって見つけることができます。 各セルの観察のために、注入されたOG -デキストランの画像が取得されます。イメージングは​​mRNAを微量注入するとき、それは定量化が核内に注入液（すなわち、デキストラン）の> 90％を受け取った細胞に限定されていることが重要です。 RNAのイメージが取得されます。 RNAの正確​​な測定を可能にするために、与えられた時間のコース内のすべてのセル間の露光時間は一定のまま、カメラのダイナミックレンジ内になければなりません。理想的には、各画像には、適切なバックグラウンド蛍光積分を計算できるようにuninjectedセルを含める必要がありますnsity（4.2.4を参照）。 定量化を支援するために、染色液DAPIの画像も取得できます。免疫蛍光が実行された場合にも、染色されたタンパク質はまた、イメージングすることができます。時間経過のさまざまなポイントでmRNAの分布の例を図4に示されています。 mRNAは分泌されたタンパク質をコードしており、したがって、COS – 7細胞のERに対象としています。 ER -ターゲットがTRAPα、常駐ERタンパク質11に対する抗体を持つRNAを共同で染色することによって検証されたことに注意してください。 定量化これは、さまざまな画像解析ソフトウェアパッケージの数で達成することができます。 ImageJのソフトウェアは、次のような、それは手動で、核と細胞質画分を分離するために使用することができる、それはこれらの画分の平均蛍光を測定することができ、その出力データは容易にコピーされ、他のソフトウェアに貼り付けることができるので、細胞mRNAの分布を定量化するために非常に適していますMicrosoft Excelの。 FISH、OG -デキストラン、およびDAPI蛍光に対応する画像が開かれ、ツールをスタックに画像を使用してマージされます。 DAPIまたはデキストラン層のどちらかにしきい値のツールは、マイクロインジェクション核に対応する領域を分離するために使用されます。この画分は、自動選択ツールを使用して選択されており、FISH層、エリア（NUC）と（F NUC）の強度の平均値/平均値に移動した後、[計測]ツールを使用して記録されます。 セルの境界は、フリーハンド選択ツールを使用して概説されている、とFISHのレイヤー上のエリア（TOT）と（F トット ）の平均強度/平均は、ものさしツールを使用して記録している間。あなたの細胞の蛍光がバックグラウンドのそれより有意に強いている場合は、しきい値ツールの代わりにあなたの所望の細胞の輪郭をフリーハ​​ンド選択ツールを使用することができます。 矩形選択機能を使用して、ボックスがuninjectedセル上に描画され、平均値/平均強度（F バック ）が記録されます。 すべての測定は、Excelワークシートにコピーされます。 エクスポートされたmRNAは、次式を用いて計算されます。 NUC 核のエリア トット 全細胞の面積 F NUC 核画分の平均蛍光 F トット 全細胞画分の平均蛍光 戻る F トランスフェクトされていない細胞の平均蛍光各時点の平均％の輸出は、時間をかけて計算し、プロットされる。 時間をかけて- mRNAの安定性は、平均総mRNAの蛍光（F バック ） トット xを（F トット ）をプロットすることにより計算されます。一般的に我々は、mRNAの量は、細胞間およびカバースリップの間で大きく異なることがわかります。これは、針の流量との間とFISH染色の効率の間に不整合が原因である可能性があります。 図1。彼らはその後、200μlのプラスチック製のピペットチップを使用して垂直方向および水平方向に負傷した70〜90％コンフルエントになるまで、 マイクロインジェクションのカバースリップ。細胞が栽培されています。クロス傷から始まる、細胞は、1傷のエッジ（矢印）に沿って注入されています。 図2。シリンジレギュレータ。 A）フロー図は、注射器のレギュレータが組み立てられる方法を示す。 B）組立装置の回路図は。 C）組み立てシリンジレギュレータの写真が。 図3。注入されたプラスミドDNAの転写に対するα-アマニチンの影響。濃度を変化させて前処理したNIH3T3線維芽細胞、α-アマニチンのsは、T – ftzを-ΔIプラスミドDNAとOG -共役70kDデキストランを注入した。注入された細胞は、37℃でインキュベートした1時間してから、特定のFISH probe6を使用してT – FTZ -ΔIのmRNAは固定と染色のためのC。各行は、OG – 70kDaデキストランおよびtは- ftz -ΔIのmRNAを画像化ビューの単一のフィールドに対応しています。薬剤の、低い高いではなく、濃度が完全にT – ftzを-ΔIの転写産物の産生を抑制することに注意してください。スケールバー=15μmの。 図4。 mRNAの核外輸送の時間経過を。COS – 7細胞は、T – ftzを-ΔIプラスミドDNAとOG -共役70kDデキストランを注入した。 30分以下の注入細胞はα-アマニチンで処理し、表示された時点で37℃でインキュベートした。細胞を固定し、tは- ftz -ΔIのmRNAに対するとERマーカーTRAPαに対する抗体とプローブで染色した。各行は、セルの単一のフィールドに対応しています。マイクロインジェクションのtimecourse以下A）mRNAの分布。 B）（）Tは、- ftz -ΔIのmRNAとERの共局在を示すことから、120分時点のブローアップ。 T – FTZ -ΔIのmRNA（緑）とTRAPα（赤）染色のオーバーレイは、右側のパネルに表示されます。スケールバー=15μmの。