在哺乳动物细胞通过显微注射mRNA的核出口动力学分析

有两个显微注射的方法，可以用来衡量在哺乳动物细胞中的mRNA出口动力学在体外合成的mRNA，或质粒DNA，这是转录为mRNA体内注射。每种技术都有其优点和缺点。在这里，我们描述了这两种技术，并讨论两种方法之间的的差异。 1。注射材料的制备 在体外转录的mRNA 包含的基因通过适当的RNA聚合酶启动子（即T7或SP6的促销员）上游两侧的利益无论从质粒或PCR产物的mRNA转录。转录是在体外适当的酶（T7或SP6 RNA聚合酶，Invitrogen公司）使用适当的核苷酸和多余的第模拟。 成绩单是聚腺苷酸化在体外用聚- A聚合酶（Invitrogen公司）和ATP根据制造商的协议。 的mRNA纯化使用Invitrogen公司或Qiagen公司列。 洗脱的mRNA，然后沉淀，加入为13,000克在4 ° C离心30min后的一小时二十分之一体积的3M醋酸钾和2卷100％的乙醇，在-20 ° C。如果存在多余的液体，颗粒可以与冰冷的70％乙醇洗涤。 导致mRNA的颗粒是空气干燥，然后在注射缓冲液（氯化钾140MM和10MM的HEPES，pH值7.4）中可溶性。请注意，任何污染物的乙醇可能是有毒的，以显微注射细胞。溶解的表达，可以保持长期储存于-80 ° C。 显微注射法，mRNA是在注射液稀释至200μg/ml和俄勒冈州绿488（OG）共轭70kDa右旋糖酐（1mg/ml的; Invitrogen公司）混合。由于OG -标记的葡聚糖是弥漫整个核孔过大，它将使之一，不仅要确定注射的细胞，但也有助于确定多少流体注入核泄漏进入细胞质多少（见4.1.2）。另外，可用于任何荧光灯，高的分子量的分子，是无法穿过核孔。 样品在4 ° C离心至少20分钟前加载针以颗粒任何微粒物质可能潜在阻碍针尖13,000克。 质粒DNA 含有目的基因的质粒DNA可制备自Qiagen使用标准的DNA纯化试剂盒。一般规模较大的DNA的准备工作往往是更高质量，从而更有效地在注射后的转录。 质粒DNA在注射液稀释50至200μg/ml含有共轭OG – 70 kDa的葡聚糖（1mg/ml的）。 装货前针，注射液在4 ° C离心20分钟，至少13,000克。 针显微注射针是编造1.0毫米硼硅玻璃毛细管（＃1B100F 3项世​​界精密仪器公司）使用一个2.5mm长丝一个萨特P97火焰山/布朗微管拖轮。 使用三个步骤拉动程序使用一个2.5×4.5毫米箱长丝（＃FB245B项目，萨特仪器有限公司），注射针头产生。下面列出了该方案在本实验中使用的参数，但是他们应该为每个灯丝优化。 步骤＃ 热 拉 速度 时间 压力 1 740 100 8 250 500 2 740 100 8 250 500 3 740 100 10 250 500 （斜坡温度= 740） 细胞制备一般来说任何哺乳动物的细胞株可显微注射，但细胞类型以及传播往往更适合注射。细胞系的选择，可能还取决于其他因素。例如，编码分泌蛋白定位到内质网表面，这是在COS – 7细胞中可见得多的mRNA NIH 3T3成纤维细胞相比，6（比较图3 T – FTZ -ΔImRNA的本地化和4）。 酸洗平方米盖玻片30毫米petridishes（25x25mm）至少2​​4小时，以显微注射前应接种于细胞。在某些细胞系，传播可以刺激电镀细胞纤维连接蛋白6,8涂盖玻片。理想情况下，细胞单层应融合在注射时间大约70-90％。 为了使注射的细胞易于识别，细胞单层伤员在注射之前，通过使用一个200μL塑料吸头。一般交叉的伤口（图1）是镌刻在盖玻片和左恢复细胞注射在组织培养孵化器前至少15分钟。 在显微注射法，组织培养介质慢慢失去的CO 2扩散，结果变成碱。为了帮助保持中性pH值在注射，媒体可以辅以10MM HEPES pH值7.4。可以添加到媒体显微注射前一天额外的缓冲区。 显微镜和微操作机器人细胞是显微注射，以最大限度地减少破坏性的显微注射过程中的振动，可隔离空气表使用倒置显微镜。该显微镜配有两个目标; 10X一块干，这是用来定位的细胞和针;和干燥的40X超长工作距离阶段的目标，这是用于显微注射过程中的形象。 如果目标已改正的领子，可以消除观看整个盖玻片和petridish细胞所造成的光学像差。确保显微镜的明是正确对齐科勒照明9的，也将有助于正确的注射针（见2.2.4）被散射光所造成的畸变。 针是由一个三轴挂操纵杆显微设备（NT – 88 – V3MSH，Narishige）控制。粗机械臂固定在显微镜的背面支柱允许针很容易提高，降低入菜，同时保留其原来的位置。 针固定在一个钳位粗机械臂的魔杖。一个管连接棒一个5CC玻璃注射器（编号＃512311; Becton Dickinson公司），从而产生所需的注射压力，弹出的显微注射针的尖端流体。要控制压力水平，针筒和活塞举行注射器稳压器包括两个塞子，管子钳（可在任何五金商店）和两个金属夹（图2）中的位置。为了确保注射器保持高压，真空润滑脂（道康宁）是适用于注射器推杆。 荧光杂交探针使用RNA二级结构预测软件，如RNAstructure 4.6 10，折叠的注入核酸的主要序列。 视评估，以确定约50个核苷酸的地区，往往是免费的二级结构与熔化温度高，如长双链，mRNA的皱褶。 本地区的反向补充Alexa546探针的5'端的荧光团合成（这些可以购买集成的DNA技术）。 该探测器是加水稀释至浓度为100μm，并储存于-80 ° C为2-3年。 2。核内微量注射载入注射液对显微注射显微镜大约注射液加入1μl是来自离心DNA或mRNA的样品使用GELoader提示（编号022351656; Epindorff）。被吸入的液体从样品的顶部，以避免破坏其中包含的微粒物质，可以堵塞针头颗粒。 吸管的尖端插入针的后端和液体喷出。通过毛细作用，液体将提请针尖和半月板附近的尖应在5 – 30秒可见。 充满液体的针插入的魔杖，然后被钳位在一个45度角的显微。 针是可视化，并与10倍的目标是在使用粗显微旋钮的焦点平面附近观看飞机的中心位置。然后将针提出了几毫米，以防止它被损坏在后面的步骤（2.2.2），然后在显微镜背面支柱推回。 压力是增加了令人沮丧的柱塞0.5 – 2CC。 显微注射观看舞台上放置一个包含一个受伤的单层petridish封面防滑。 显微镜背面的支柱，是向前拉直立的位置，造成要对齐的冷凝器和针头进入液体。这项工作应小心，以防止从打破的盖玻片上针（见2.1.4）。 使用10倍的目标，中心的交叉伤口是识别和定位针以上细胞被注入。 增加放大倍率切换到40倍的目标，并使用操纵杆上的微调旋钮，针是降低中心。如果图像是重点，必须确保正确对准入射光（即Kölher照明9）使用伯特兰透镜（见1.5.2）。 注射开始在一个角落里的伤口交叉和继续沿着可视化过程中注入细胞（见图1）易于识别的一个边缘。 针是降低使细胞核的联系。人们可以很容易地告诉一个细胞已被注入阶段亮度显着的变化，伴随着注射。 如果液体填满了整个细胞，它可能表明压力过高，需要降低。 如果没有在第一阶段的亮度变化被检测到，这可能表明的显微注射压力是不是强大到足以刺穿细胞膜，或针尖堵塞。这可能会导致的问题包括：压力不足，不完善的地方，在针的针尖与小颗粒物质堵塞。由于加载到每个显微针费时，而且因为注射基板往往是非常宝贵的，重要的是要最大限度地发挥，可以有效地用于注射针的百分比。以下是一步一步试图疏通堵塞针头的指导。每个步骤后，应尽量注入2 3cells，以评估是否阻塞已被删除： 行动 目的和目标 1 调整焦距，以查看针头的长度。 要确定是否有明显的不完善针或是否有大块的微粒阻塞针尖。 2 广场旁边的颗粒在盘中的浮动片针尖。 如果流体是退出的提示，应该鼓动没有直接接触与针粒子。 3 压下注射器的柱塞这种临时增加的压力，应该明确的提示任何阻碍。释放柱塞后，应根据自身上升，如果它不，这意味着压力不被内置在注射器中，你需要拧紧连接和/或添加额外的真空润滑脂。 4 提高针细胞MEDIA 针抽出的水介质的力量可以帮助逐出针尖的障碍物。 5 从注射器的柱塞完全删除并重新插入。 这额外增加的压力，可能需要明确针尖。 6 刮开一个干净盖玻片部分的针尖这进一步搅拌针内的微粒和帮助重新定位，以纾缓在提示梗阻。更强的划伤芯片关闭提示结束，使梗阻退出针。 7 装入一个新的针另一个常见的​​问题是针内的压力逐渐丧失，需要通过进一步压低在注射器的柱塞频繁赔偿。通常情况下，添加额​​外的真空润滑脂注射器推杆可以帮助保持更一致的压力。然而，这个问题可能是由于泄漏的注射器和管，管，棒，或棒和针之间的连接。大多数漏气，可密封，用封口膜（费舍尔），或者，如果必要的油脂，虽然棒和针之间的泄漏只能通过改变橡胶垫片的魔杖纠正。 沿伤口边缘细胞显微注射伤口边缘沿一个固定的时间内（10-15分钟）。随着实践的几百个细胞可以在此期间注入。 显微注射后，细胞在37 °所需的时间量内固定前组织培养孵化器在彗星。如果注射的DNA，转录终止治疗与α-鹅膏蕈碱（1μg/ml; Sigma – Aldrich公司）的细胞在生长介质中溶解20min后。这种集中，有效地抑制从显微注射质粒（图3）的转录。 可重复使用单针注入多个盖玻片，虽然需要更换一个变化的DNA或RNA的类型时，是显微注射针。一旦针头从魔杖中删除是应该予以处置，不重用。 死或浮动细胞偶尔坚持针尖，可以用显微注射的干扰。针要删除这个碎片，提高液体的针推回支柱，然后慢慢调整的支柱，以直立的位置退针重新插入液体。 要获得的mRNA核出口动力学测量的精确测量，独立的样品应固定在0分钟，15分钟，30分钟，60分钟和120分钟后的RNA显微注射，或α-鹅膏蕈碱处理后。 3。细胞固定和染色细胞固定和通透在适当的时候，吸气和两次用2 ml PBS液（137mM氯化钠，氯化钾2.7毫米，10毫米娜2 HPO 4，2mm的KH 2 PO 4，pH值7.4）洗细胞生长介质。重要的是要保持湿润，尽量减少他们不被淹没在液体中的时间盖玻片。 细胞是固定的，至少在室温15分钟，加入4％多聚甲醛的PBS（电子显微镜科学）2毫升。 固定标本用PBS液洗两次。 细胞透2毫升0.1％的Triton的PBS X – 100的在室温下至少15分钟。 样品用PBS液洗两次。 鱼染色接下来的样品需要准备杂交。 1X SSC的解决方案（150MM 15MM柠檬酸钠，氯化钠，pH值7.0）25-60％formimide的细胞是洗两次。甲酰胺量，使用相同的杂交液中的浓度（见3.2.3）。 要准备染色室，一个150毫米petridish底部覆盖着水和一块的封口膜对水浮动。水是去除菜，从而使封口膜，以坚持的菜底部。手动重新气泡感动。 对于每个盖玻片染色，100μL滴杂交液（25-60％甲酰胺，葡聚糖硫酸100mg/ml，1mg/ml的E.大肠杆菌 tRNA的，5MM在1x SSC钒核苷探针稀释1:500复杂）吸管到的封口膜。请注意，甲酰胺量应为正在使用的特定鱼类探头优化。 产钳的帮助下，盖玻片从30毫米petridish删除，然后使用的Whatman滤纸（VWR）背面盖玻片（无细胞的一面）是干燥和多余的缓冲区是从前端的恶人，不干燥固定细胞。盖玻片，然后放置面临到鱼解决方案。这是每个盖玻片重复。 配售染色室盖后，样品在37 ° C培养18小时5 洗涤和安装的彩色样品一些洗涤商会是由在染色室相同的方式（见3.2.2）。 对于每个盖玻片，1毫升的洗涤缓冲液（1X 25-60％甲酰胺的SCC）是吸管上的封口膜的清洗室。同样，使用相同浓度的甲酰胺杂交液中（见3.2.3）。 要删除从染色室盖玻片，洗涤缓冲液1毫升吸管旁边的盖玻片。下面每个样品通过毛细作用，液体应制定。 使用镊子，盖玻片删除，每到置于缓冲液洗的下降，在室温下孵育5 min。 重复步骤3.3.2至3.3.4的两倍以上，使每个盖玻片洗净，共3次。 如果RNA是由免疫与一些蛋白质costained，见3.4节。 幻灯片用70％乙醇洗涤，晒干和Kimwipes。对于每个盖玻片，用DAPI（Fluoromount G，南方生物技术）的解决方案安装10-30液吸管上的幻灯片。每张幻灯片都可以容纳两个盖玻片。 盖玻片的背面是使用镊子和滤纸过滤纸，干燥和多余的液体是关闭盖玻片前端的恶人，而干燥的样品。每个盖玻片，然后放置面朝下，到安装解决方案中。 安装样品可存放于4 ° C。 免疫荧光染色样品必须用PBS冲洗两次，去除甲酰胺，可干扰正确的抗体染色。 对于每个盖玻片，初级抗体溶液（1.0μg/ml抗体，0.1％，为0.1mg/ml TX – 100无RNase BSA在PBS）50μL吸管到洗涤室的封口膜。 使用镊子，盖玻片放置细胞端上的主要抗体解决方案，并允许在室温下孵育30分钟。 对于每个盖玻片，两个1毫升滴的PBS洗涤室的封口膜吸管上。 要删除抗体染色溶液的盖玻​​片，PBS1毫升吸管盖玻片。下面每个样品通过毛细作用，液体应制定。 使用镊子，盖玻片删除，每次被放置到5分钟的PBS首次下降，然后放置到另一个5分钟的第二个下拉的PBS。 步骤3.4.2至3.4.6重复使用的荧光二抗溶液（1.0μg/ml抗体，0.1％，为0.1mg/ml BSA在PBS TX – 100）。请注意，因为注射标记和RNA在可见的红色和绿色通道，二级抗体，必须结合Alexa647兼容，如染料。 盖玻片装在3.3.7。 4。成像和定量成像 epifluorescence显微镜是用于注射后的细胞图像。注射细胞可位于定位交叉的伤口，并确定细胞注入标记（OG -葡聚糖）。 对于观察到的每一个细胞，注入的OG -葡聚糖的图片被收购。当成像注射基因是很重要的量化是有限的进入细胞核的细胞> 90％的注射液（即右旋糖酐）。 然后获得的RNA的图像。为了让RNA的精确测量，在一个给定的时间当然所有细胞之间的接触时间应保持不变和下降相机的动态范围内。理想情况下，每个图像应包括uninjected细胞能够正确计算背景荧光INTEnsity（见4.2.4）。 为了帮助在量化的DAPI染色的图像也可以收购。此外，如果进行免疫荧光染色的蛋白质也可以进行成像。基因在不同的点分布在一个时间过程的一个例子是如图4所示。该基因编码一种分泌蛋白，从而有针对性地在COS – 7细胞ER的。请注意，在ER目标是通过合作与TRAPα，驻地ER 蛋白 11抗体染色的RNA验证。 量化这可以与许多不同的图像分析软件包。 ImageJ软件是非常适合量化，因为它可以用于手动分离细胞核和细胞质组分细胞mRNA的分布，它可以测量这些分数的平均荧光，其输出的数据可以很容易复制和粘贴到其他软件，如， Microsoft Excel中。 鱼，OG -葡聚糖和DAPI荧光图像，使用图像堆栈工具打开和合并。 无论是在DAPI或右旋糖酐层的阈值工具用于隔离该区域相应的显微注射核。这个分数是选择使用的魔杖工具，并移动到鱼层，面积（NUC），平均/平均强度（NUC）后使用的测量工具记录。 细胞周长概述采用写意选择工具，而在鱼层面积（TOT），平均/平均强度（F TOT）记录使用的测量工具。如果你的细胞的荧光明显超过背景激烈，您可以使用“阈值”的工具，而不是写意选择工具来概括您所需要的细胞。 使用矩形选择功能，uninjected细胞和记录平均/平均强度（六回 ）绘制一个框。 所有测量都复制到Excel工作表。 出口的mRNA使用下列公式计算： 一国统会 细胞核的面积一个TOT 整个小区的面积 F 国统会 核分数的平均荧光女共计 整个小区的一小部分的平均荧光 F 返回 未转染细胞的平均荧光每个时间点的平均％出口计算，并随着时间的推移绘制。 mRNA稳定性的计算方法是绘制的平均总mRNA的荧光（ 一TOT（女共计- F））随着时间的推移。通常情况下，我们发现，细胞之间和盖玻片之间的mRNA量良莠不齐。这可能是由于针流速和鱼染色效率之间的不一致。 图1。显微注射盖玻片。细胞生长，直到他们70-90％汇合，然后受伤，水平和垂直方向使用200μL塑料枪头。从十字架上的伤口开始，细胞被注入沿伤口边缘（箭头）。 图2。注射器调节。一）流程图演示如何组装注射器调节。二）组装设备的示意图。 C）组装的注射器调节照片。 图3。对α-鹅膏蕈碱的NIH3T3成纤维细胞，这与不同浓度的前处理注射质粒DNA的转录 。S，α-鹅膏蕈碱注射用T – FTZ -ΔI质粒DNA和OG -共轭70kD葡聚糖。注射细胞在37 ° C为1小时，然后T – FTZ -ΔI使用一个特定的鱼的基因probe6的固定和染色。每一行对应的观点的单一领域的OG – 70kDa葡聚糖和T – FTZ -ΔI表达成像。注意药物浓度高，但也不低，完全抑制了生产的T – FTZ -ΔI成绩单。比例尺=15μm的。 图4。时间当然mRNA的核出口。COS – 7细胞注射用T – FTZ -ΔI质粒DNA和OG -共轭70kD葡聚糖。与α-鹅膏蕈碱30分钟注射后的细胞经培养，在37 ° C在指定的时间点。固定细胞，然后与探针对T – FTZ -ΔImRNA和对ER标记TRAPα的抗体染色。每一行对应一个单细胞领域。一）mRNA的分布后，显微注射法timecourse。 B）从（A），120分钟的时间点的打击，表明T – FTZ -ΔImRNA和急诊室的合作本地化。覆盖的T – FTZ -ΔI的mRNA（绿色）和TRAPα（红色）染色，显示在右侧面板中。比例尺=15μm的。