Rápida ciclagem térmica PCR usando convecção térmica em micro

1. Projeto Básico do Termociclador por convecção Temos construído um dispositivo simples termociclagem convectivas consistindo de plástico intercambiáveis ​​reação de câmara "cartuchos" que são colocados entre duas placas de alumínio, cuja temperatura é controlada de forma independente 7 (Figura 2). Poços reator cilíndrico são incorporados por matrizes de usinagem de furos nos blocos de policarbonato, com diferentes combinações de diâmetro do furo e espessura da chapa de plástico utilizados para alcançar as proporções desejadas (altura / diâmetro = h / d). Duas geometrias diferentes reator são considerados nos resultados apresentados aqui: h / d = 9: h = 15.9 mm, d = 1,75 mm, volume de 38,2 mL; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 mL volume. A superfície inferior do reator é aquecida através de um bloco de alumínio contendo aquecedores de cartucho de interface com um controlador de temperatura microprocesser conduzido. A temperatura na superfície superior do reator é regulada através de um bloco de alumínio conectado a um banho de água de recirculação. Todo o conjunto é preso em conjunto, utilizando parafusos de nylon para limitar a condução térmica entre os blocos de alumínio adversária. 2. Preparação e carregamento da mistura de reação de PCR Um típico 100 mL mistura de reação contém 10 mL de solução-tampão 10x, 6 mL de 25 mM MgCl 2, 10 mL de dNTPs (2 mM cada), 41,2 mL de água DI, 10 mL de β-actina sonda, 10 mL de β -actina cartilha para a frente, 10 mL de β-actina primer reverso, 2 mL de DNA genômico modelo humano (10 ng / mL) e 0,8 mL de Kod DNA polimerase (2,5 unidades / mL). Antes de carregar reagentes, selar a superfície inferior da câmara de PCR usando uma folha fina de fita de alumínio. Lave os poços com um reator de 10 mg / ml de solução aquosa de albumina de soro bovino seguido por Rain-X Anti-Fog. Reagentes pipeta no reator usando poços longo dicas gel de carregamento de pipeta e selar a superfície superior com fita Teflon FEP. 3. Executando a reação no termociclador por convecção Antes de iniciar a reação, os blocos de pré-aquecimento de alumínio tanto para o desejado temperaturas da superfície superior e inferior. Sandwich do reator de plástico carregado com PCR reagentes entre os blocos de aquecimento de alumínio, pinça e rapidamente a montagem em conjunto, utilizando parafusos de nylon. Após a reação prosseguiu para o tempo desejado, desligue os aquecedores e coloque a superfície inferior (quente) do dispositivo em cima de um bloco de metal refrigerados rapidamente resfriá-lo e parar o fluxo convectivo. Remova o reator de plástico e pipeta os produtos para fora dos poços (com as dicas de carga de longo gel) para posterior análise. 4. Realização de análise Eletroforese em Gel Prepare a 2% em peso agarose gel por aquecimento de 10 g de agarose com 500 mL de tampão 1x em uma placa quente mexendo até que a solução se torna claro. Carregar o gel agarose na bandeja de fundição e inserir o pente. Deixe o conjunto de gel para ~ 30 min. Retirar o pente e adicionar tampão TAE 1x até que o gel está submerso. Fluorescente amostras de DNA manchado conter 2 mL 100x SYBR Green solução I, 2 mL de amostra de DNA, 2 mL Dye Carregando 6x Orange, e 4 tampão TAE mL. Adicionar as amostras de DNA para os poços e executar a separação em 60 V para 1 h com uma bp DNA ladder 100 marcador de dimensionamento. Remover o gel e fotografá-lo sob a luz UV para obter o resultado. 5. Resultados representativos: Projeto ótimo de termocicladores convectivas envolve a escolha correta da geometria do reator que irá gerar um fluxo circulatório capaz de transportar os reagentes através da chave temperaturas envolvidas no processo de PCR. Os parâmetros geométricos que podem ser variadas nos reatores cilíndricos aqui considerados são a altura (h) e diâmetro (d), ou equivalentemente a proporção (h / d). Nós exploramos os campos 3-D do fluxo dentro convectivas reatores PCR em um intervalo de proporções diferentes, utilizando dinâmica de fluidos computacional (CFD), e descobriram que os padrões complexos podem surgir inesperadamente. Mais importante ainda, nossa análise revelou um subconjunto desses campos fluxo complexo que acelerar significativamente a reação 12. Estes efeitos geométricos podem ser vistos claramente, comparando os campos de fluxo em reatores em proporções altas e baixas. No caso de alta proporção (h / d = 9; um cilindro alto e magro), elementos de fluido são advected ao longo de trajetórias traçando caminhos que são essencialmente fechado loops, e eles são locked-in para seguir os mesmos caminhos por longos períodos de tempo (Figura 3a). Conseqüentemente, há pouca oportunidade de intercâmbio entre ftrajetórias baixo que exponha os reagentes para a seqüência ideal de condições térmicas para a PCR (oscilando entre o recozimento e desnaturação extremos em superfícies superior e inferior do reator) eo conjunto muito maior de trajetórias restantes que não contribuem para a amplificação (localizada mais perto do centro do reator). O campo de fluxo é muito diferente em uma proporção menor de aspecto (h / d = 3; um curto cilindro, mais amplo), tornando-se mais caótica no sentido de que as trajetórias elemento de fluido não seguem caminhos fechados (Figura 3b). Assim, embora os reagentes são submetidos a um perfil de temperatura mais complexos, os elementos fluidos são capazes de explorar uma gama muito maior de trajetórias para que mais do volume de reagente tem uma ótima oportunidade de experimentar perfis térmicos. Estes resultados sugerem que, embora contraintuitivamente trajetórias de fluxo individuais em h / d = 09 de maio parecem ser mais favoráveis ​​para a PCR, produzindo perfis de temperatura que "olhar" similares aos empregados em um termociclador convencional, a natureza caótica do campo de fluxo em h / d = 3, em última análise domina em uma escala global, promovendo maior intercâmbio para que os reagentes não ficam presas em trajetórias desfavoráveis ​​por muito tempo. Para testar essa hipótese e determinar qual a geometria do reator foi mais favorável para a PCR, usamos os dois para realizar a replicação PCR de um alvo de 295 bp associado com o gene β-actina de um modelo de DNA genômico humano. Notavelmente, rotineiramente alcançados amplificação do produto alvo correto em apenas 10 min em h / d = 3 (Figura 4a), enquanto a mesma reação necessários pelo menos 20 minutos antes de os produtos detectáveis ​​foram observadas em h / d = 9 (Figura 4b) . A especificidade de reação também é muito maior em h / d = 3, onde um produto PCR simples é obtido, enquanto vários produtos inespecíficos são gerados em h / d = 9, onde as armadilhas do fluxo líquido no campo de elementos desfavoráveis ​​trajetórias térmica por longos períodos de tempo. Figura 1. Convecção térmica em uma câmara cilíndrica, cuja parte superior e inferior superfícies são mantidas em diferentes temperaturas fixas. Se a temperatura na superfície inferior é maior do que no topo, um gradiente de densidade vertical é estabelecida dentro do fluido fechado que é capaz de gerar um padrão de fluxo circulatório. Com a escolha certa de parâmetros geométricos (altura e diâmetro d h), o campo de fluxo convectivo pode ser aproveitada para accionar termociclagem PCR quando as superfícies superior e inferior são manintained perto recozimento e temperaturas de desnaturação, respectivamente (a gravidade atua verticalmente para baixo). Figura 2. (A) Os principais componentes de um fluxo de convecção PCR thermocyler. Um cartucho de reator consiste de um bloco de policarbonato contendo um conjunto de câmaras cilíndricas. O bloco está entre uma placa superior projetado para ser conectado a um banho de água circulante e uma placa inferior incorporando aquecedores embutidos. (B) Os reagentes PCR são carregados e lacrados dentro do cartucho do reator, após o qual o dispositivo é montado para realizar a reação. Após a conclusão, o procucts pode ser facilmente pipetado para análises posteriores. Figura 3. Simulações computacionais de 3-D campos fluxo convectivo gerado dentro de reatores cilíndricos com temperaturas de 53 e 96 ° C impostas nas superfícies superior e inferior, respectivamente. Resultados são mostrados na razão de aspecto de (a) h / d = 9 (38,2 mL de volume do reator) e (b) h / d = 3 (18,5 mL de volume do reator). A trajetória representante seguido por um elemento fluido viajar através do campo de fluxo 3D é mostrado à esquerda junto com projeções vista superior e lateral do caminho; a trama correspondente da temperatura versus tempo após um elemento de fluido é mostrado à direita. O perfil térmico em 9 = h / d aparece próximo ao de um termociclador convencional, mas o campo de fluxo caótico, 3 = h / d é contraintuitivamente mais favorável para PCR. Figura 4. DNA replicação resultados obtidos nas geometrias reator mostrado na Figura 3 (superior e inferior superfícies foram mantidas em 53 e 96 ° C, respectivamente). (A) PCR é muito acelerado, 3 = h / d, como é evidente pelos produtos fortes visível após apenas 10 min de tempo de reação (M: 100 bp ladder, faixas 1-4: produtos de reações paralelas em 4 diferentes câmaras cilíndricas). (B </strong>) A mesma reação realizada em 9 = h / d exige pelo menos 20 minutos antes de os produtos visíveis são observadas, e várias bandas estão indicando replicação evidente de não-específica do DNA alvo, além do produto desejado (M: 100 bp ladder, faixas 1-2: produtos de reações paralelas em duas diferentes câmaras cilíndricas).