Transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos
Summary
Oligonucleótidos se puede utilizar para sustituir a un sitio concreto de un solo nucleótido de los genes diana transfectadas en ambos<em> Anopheles gambiae</em> Y<em> Anopheles stephensi</em> Células.
Abstract
Parásitos Plasmodium, el agente causante de la malaria, se transmite por la picadura de mosquitos anofeles infectados que resulta en más de 250 millones de nuevas infecciones cada año. A pesar de décadas de investigación, aún no existe una vacuna contra la malaria, destacando la necesidad de estrategias de control de la novela. Un enfoque innovador es el uso de mosquitos genéticamente modificados para controlar de forma efectiva la transmisión de parásitos de malaria. Alteraciones deliberadas de vías de señalización celular en el mosquito, a través de mutagénesis dirigida, se han encontrado para regular el desarrollo del parásito 1. A partir de estos estudios, podemos empezar a identificar posibles objetivos para la transformación genética. Mutagénesis dirigida se ha basado tradicionalmente en la recombinación homóloga entre un gen diana y una molécula de ADN de gran tamaño. Sin embargo, la construcción y el uso de tales moléculas de ADN complejo para la generación de líneas celulares transformadas de forma estable es costoso, lento y con frecuencia ineficientes. Por lo tanto, una estrategia de uso de ácido nucleico cerrado modificado-oligonucleótidos (LNA-ons) ofrece una alternativa útil para la introducción artificial sustituciones de un solo nucleótido en el gen episomal objetivos y ADN cromosómico (revisado en 2). LNA-ON mediada por mutagénesis dirigida se ha utilizado para introducir mutaciones puntuales en genes de interés en cultivos de células de levadura y 3,4 ratones. Mostramos aquí que LNA complementos pueden ser utilizados para introducir un cambio de nucleótido único en un objetivo episomal transfectadas que se traduce en un cambio de la proteína fluorescente azul (BFP) expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) de expresión, tanto en Anopheles gambiae y Anopheles stephensi células . Esta conversión se demuestra por primera vez que la mutagénesis eficaz de los genes diana en las células de mosquito puede estar mediado por LNA-ons y sugiere que esta técnica puede ser aplicable a la mutagénesis de los objetivos cromosómicas in vitro e in vivo.
Protocol
Discussion
Aquí presentamos un método in vitro y las pruebas para la conversión selectiva de un solo nucleótido en el gen episomal un objetivo después de la transfección de LNA-Ons en A. stephensi y A. gambiae células. LNA-ON mediada por la conversión de genes requiere la inducción de un sitio específico de la respuesta de reparación del ADN, nuestros datos indican que las células de mosquito puede apoyar este mecanismo de mutagénesis sitio-específica. Mientras que el método que a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Abbie Spinner en el Centro Nacional de Investigación de Primates de California por su ayuda con la citometría de flujo. Este estudio fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), Institutos Nacionales de Salud (NIH) AI073745, AI080799 y AI078183.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
Referenzen
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