Трансфекция и мутагенеза генов-мишеней в Mosquito ячейки путем Закрытые нуклеиновых кислот модифицированных олигонуклеотидов
Summary
Олигонуклеотиды могут быть использованы для сайта специально заменой одного нуклеотида трансфицированных генов-мишеней в обоих<em> Anopheles gambiae</em> И<em> Anopheles stephensi</em> Клеток.
Abstract
Plasmodium паразитов, возбудителей малярии, которые передаются через укусы инфицированных комаров Anopheles в результате которых более 250 млн. новых случаев инфицирования ежегодно. Несмотря на десятилетия исследований, до сих пор нет вакцины против малярии, подчеркивая необходимость разработки стратегий роман контроля. Одним из новаторских подхода является использование генетически модифицированных комаров для эффективного контроля передачи малярии. Умышленные изменения клеточных сигнальных путей в организме комара, с помощью направленного мутагенеза, были обнаружены регулировать паразита развития 1. На основании этих исследований, мы можем начать определять потенциальные цели гена для трансформации. Целевые мутагенеза традиционно полагались на гомологичной рекомбинации между гена-мишени и большой молекулы ДНК. Тем не менее, строительство и использование таких сложных молекул ДНК для генерации стабильно трансформированные клеточные линии стоит дорого, отнимает много времени и часто неэффективны. Таким образом, стратегию, используя заблокирован нуклеиновых кислот-модифицированных олигонуклеотидов (LNA дополнений) обеспечивает полезную альтернативу для введения искусственного одиночных нуклеотидных замен в эписомной и хромосомной ДНК гена целями (см. обзор 2). МШУ-НА-опосредованной направленного мутагенеза были использованы для введения точечных мутаций в генах интереса к культуре клеток, так дрожжей и мышей 3,4. Мы покажем здесь, что LNA дополнений может быть использован для внедрения одного нуклеотида изменение трансфицированных эписомной цель, которая приводит к переключаться с синим флуоресцентным белком (ПСБ) выражение на зеленый флуоресцентный белок (GFP) выражение в обеих Anopheles gambiae и Anopheles stephensi клетки . Это преобразование демонстрирует в первый раз, что эффективное мутагенеза генов-мишеней в комара клетки могут быть опосредованы LNA дополнений и предполагает, что этот метод может быть применим к мутагенеза хромосомных цели в пробирке и в естественных условиях.
Protocol
Discussion
Здесь мы представляем в пробирке и метод доказательства для целевого преобразования одного нуклеотида в эписомной гена-мишени после трансфекции МШУ дополнений в A. stephensi и А. gambiae клетках. МШУ-НА-опосредованной генной конверсии требует индукции сайт-специфического ответ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Эбби Spinner в Калифорнийском Национального центра изучения приматов за помощь с проточной цитометрии. Это исследование было поддержано финансирование из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) Национального института здоровья (NIH) AI073745, AI080799 и AI078183.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
Referenzen
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
