Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll
Summary
Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour des analyses de cytométrie en flux.
Abstract
Isolement des cellules du système immunitaire qui infiltrent le système nerveux central (SNC) lors d'une infection, un traumatisme, une auto-immunité ou de la neurodégénérescence, est souvent nécessaire pour définir leur phénotype et les fonctions effectrices. Des approches histochimiques sont instrumentales pour déterminer l'emplacement des cellules infiltrant et d'analyser le système nerveux central pathologie associée. Cependant, in situ histochimie et techniques en immunofluorescence sont limitées par le nombre d'anticorps qui peuvent être utilisés à un moment unique pour caractériser les sous-types de cellules immunitaires dans un tissu particulier. Par conséquent, les approches histologiques en conjonction avec le système immunitaire de phénotypage en cytométrie en flux sont essentielles pour caractériser complètement la composition de l'infiltration du SNC locales. Ce protocole est basé sur la séparation des suspensions cellulaires du SNC au cours gradients de Percoll discontinu. Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour l'identification des différentes populations de cellules immunitaires dans un seul échantillon par cytométrie en flux.
Protocol
Discussion
Les analyses des marqueurs de surface cellulaire dans les leucocytes dans les tissus du système nerveux central de souris normales et enflammée a été utilisé pendant plusieurs décennies 1-3. Protocoles d'isolement sont basés dans la séparation de la microglie et des leucocytes par centrifugation 4 densité. Nous décrivons ici une méthode rapide et efficace d'isoler les leucocytes SNC utilisant gradients de Percoll discontinu. Après isolement des cellules, la coloration avec des a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Multiple Sclerosis Society (AT 3021-A1 / T pour AEC) et l'Université du Texas à San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
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