Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten
Summary
Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für den durchflusszytometrischen Analysen genutzt werden können.
Abstract
Isolierung von Immunzellen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) während der Infektion, Trauma, Autoimmunität oder Neurodegeneration zu infiltrieren, ist oft erforderlich, um ihren Phänotyp und Effektor-Funktionen zu definieren. Histochemische Ansätze sind instrumental, um die Lage der infiltrierenden Zellen zu bestimmen und die damit verbundenen ZNS-Pathologie zu analysieren. Allerdings sind in-situ Histochemie und Immunfluoreszenzfärbung Techniken durch die Anzahl der Antikörper, die zu einem einzigen Zeitpunkt genutzt werden, um Immunzellen Subtypen in einem bestimmten Gewebe zu charakterisieren können, beschränkt. Daher sind histologische Ansätze in Verbindung mit Immun-Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie kritischen vollständig zu charakterisieren die Zusammensetzung der lokalen ZNS Infiltration. Dieses Protokoll basiert auf der Trennung von ZNS-Zellsuspensionen über diskontinuierliche Percoll Gradienten basiert. Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für die Identifizierung von verschiedenen Immunzellen Populationen in einer einzigen Probe mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.
Protocol
Discussion
Analysen von Zelloberflächenmarker in CNS Leukozyten aus normalen und entzündeten Mausgeweben seit mehreren Jahrzehnten 1-3 verwendet worden. Isolation Protokolle sind in der Trennung von Mikroglia und Leukozyten durch Dichtezentrifugation 4. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zur Isolierung von CNS Leukozyten mit diskontinuierlichen Percoll-Gradienten. Nach der Isolierung von Zellen, Färbung mit verschiedenen Antikörpern wie, aber nicht beschränkt auf-CD45 ermöglicht CD…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T, um AEC) und der University of Texas at San Antonio unterstützt.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
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