Экологически индуцированные наследственные изменения в Лен

1. Рост льна под вызывающих условиях. 5 "горшки заполнены почвой и окреп. Три семян на горшок высаживают ¼ дюйма и почвы подтвердили более семян. Горшки затем поливают с 100 мл соответствующего питательных растворов , Не вызывающие контроля (С) условия использования 1 / 10 силы Miracle-Gro каждую неделю. Высокой питательной условие (NPK лечения) имели полную силу Чудо Grow применяется в неделю. Низкий питательной – растения было только водопроводная вода применяется на протяжении всей их роста. (Даррант 1971 году Cullis 1980). Растения выращивают при естественном освещении, в течение лета. Зимой они выращиваются под натриевые фонари с 16 / 8 час свет / темно-цикла. С интервалом в неделю листья и меристем собираются. Растительного материала быстро замораживали в жидком азоте. Результаты Три генотипа расти на различных относительных скоростей в зависимости от условий (рис. 1). Поэтому под контроль условий линии Pl лучше всего растет с L быть более энергичным, чем S (рис. 1а). В условиях низкой питательные вещества (воды), S растет лучше, чем любой L или Р (рис. 1b). При высокой питательных веществ (NPK) L растет лучше, чем Pl которых только растет несколько лучше, чем S (рис. 1в). Сравнение между каждой из линий, выращенных в трех различных процедур показано на рисунке 1 г – f. Pl лучше всего растет под контроль условий (рис. 1, г), L лучших условиях высокой питательной (рис. 1e) и S аналогичным образом под обоими высокими питательными и контроля условий (рис. 1е). Эти данные показывают, что три строчки могут быть дифференцированы в зависимости от их роста в трех средах. Стоит отметить, что Pl лучше всего растет под контроль условия в то время как L лучше всего растет в условиях NPK (под которой он был индуцированной). S растет примерно в то же во всех трех условий, то есть она не в состоянии воспользоваться преимуществами улучшенной питательной условиях, но лучше способны расти при очень низких питательных условиях. Параметры роста, которые имеют отношение к дифференциации растения включают высота растения (и связанных с этим междоузлия длиной, то есть расстояние между каждым слоем), размер листа и степенью ветвления. Для Pl под контролем условиях завода высотой с филиалами и листья большие и темно-зеленый. В условиях низкой питательные вещества растение очень короткий, расстояние между каждым листом также очень короткая и листья мелкие и светло-зеленые. Листьев на кончике являются темно-зеленый, чем те, внизу стебля. При высокой питательные вещества растение выглядит очень похоже на условиях под контролем исключением того, что как главный стебель и боковые побеги короче, чем у контрольных растений. Для больших genotroph растения очень похожи на тех Pl исключением того, что наиболее бурный рост в условиях высоких питательных веществ. Снова под низкие питательные вещества растение очень короткая и имеет светло-зеленые листья. S genotroph растет так же во всех трех средах, хотя листья светло-зеленого под низкие питательные вещества. Однако в условиях низкой питательной S genotroph намного более энергичным, чем любой из Pl или L линии. 2. РНК и ДНК выписки из меристем льна и листья делаются отдельно. Рош общей РНК приготовительные комплект был использован для экстракции РНК и Qiagen DNeasy завод ДНК приготовительные комплект был использован для извлечения ДНК. Добыча РНК 3 меристем плюс некоторые окружающие листья перемещаются со склада криопробирку в трубку Eppendorf и помещают в жидкий азот пока не готова к земле. Стерильные песок добавляется в трубке и ткани местности с помощью micropestle пока нормально. 400 ул лизиса / буфера для связывания с Рош общей РНК приготовительные комплект добавлены и ткани еще больше земли, пока не видны скопления. Пробы перемешивали в течение 15 секунд, чтобы помочь лизис, а затем нити в течение 1 мин при 13000 оборотов в минуту для сбора песка и любой мусор. Супернатант добавляется спин колонки и остальной РНК приготовительные инструкции комплект следуют по назначению. ДНКазы лечения 1 / 10 образцов РНК объема 10X буфера ДНКазы добавляется. 30 единиц ДНКазы добавляется и реакции инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин и 70 ° С в течение 5 мин. Обратной транскрипции Applied Biosystems РНК кДНК комплекта используется как в направлениях, реакция инкубировали при 37 ° С в течение 1 часа и 95 ° С в течение 5 минут. КДНК, которая затем используется в ПЦР или КПЦР КПЦР КПЦР проводили с использованием Шаг ABI Одна система. Все анализы были проведены в трех экземплярах, на каждом счете. Гена актина использовали в качестве контроля количества копий, какнаилучших имеющихся генов домашнего хозяйства. Соответствующие пары праймеров был добавлен в каждой пробирке в 1 мкл. КДНК разбавляют до нужной концентрации и 9μl добавляли в каждую пробирку 10 мкл Силы 2x SYBR Green ПЦР Mastermix (ABI) и был добавлен в каждую пробирку Программа Программа усиления было: 10 минут при 95 ° C 40 циклов 15 сек при 95 ° С, 1 мин при 60 ° C Тепловая денатурация шаг для проверки усиления специфичности Относительные уровни экспрессии определяется значение 2 (CTunknown – CTactin). Препарата ДНК Буфер AP1 от Qiagen DNeasy завод ДНК приготовительные комплект добавлены до 6 листьев с стерильным песком в микроцентрифуге трубки. Ткань землю micropestle пока нет скопления видны. Комплект инструкций следуют по назначению. Результаты ПЦР-амплификации с ДНК, выделенной из листьев на различных позициях вдоль ствола показывает, что появление ЛИС-1 происходит в то время как растения растут под вызывающие условия (4). КПЦР результаты показывают, что наличие ЛИС-1 (или другие изменения генома связано с индукцией) влияет на экспрессию генов в непосредственной близости от ЛИС-1 (рис. 2). Шесть генов показано на рисунке 2 все-разному экспрессируются в Р и S с четырьмя имеющие высшее выражение в PL (без ЛИС-1) и две, имеющие высшее выражение в S (которая имеет ЛИС-1). Секция 1 и 2 двух генов ближе всего к точке вставки из ЛИС-1. Экспрессия этих генов с в большой genotroph (которая была изменений, вызванных, но не имеет ЛИС-1) и выражение в различных условиях роста будут необходимы, чтобы определить какой-либо причинно-следственной связи между библиотечно-1 и выражения. Рисунок 1. Pl, L и S, выращенных в трех различных питательных режимов. Панели – контроль, б – низкие питательные вещества и с – NPK. г – Pl, э – S, F – Л. панели D – F слева направо: низкие питательные вещества, контроля и NPK. D – Pl, э – L, F – S. Рисунок 2. Экспрессия генов вокруг точки вставки ЛИС-1. Генная 1 (ингибитора роста) сразу 5 'к LIs1 и ген 2 (Кип связанных циклинзависимых идентификатор ингибитор киназы 3 "ЛИС-1. Других генов, все по той же леса (~ 500кб) построены из полный геном льна последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы видеть большую фигуру . Рисунок 3. ПЦР-амплификации ДНК, извлеченных из отдельных листьев растений Стормонт Cirrus, выращенных в условиях низкой питательной. ПЦР-продукты были разделены на 2% агарозном-TBE геля. Uninserted сайте показана в панели, два конца вставлена ​​сайте показаны на панели В и С. Лист образцов 1 – 6 были изолированы с интервалом в неделю с образцом 1 будучи ранним после посева.