Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie zu Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt.
Abstract
Eines der wichtigsten Ziele in den Neurowissenschaften ist es, die molekularen Signale, die frühen Stadien der Synapsenbildung anweisen, zu verstehen. Als solches ist es unumgänglich geworden, um objektive Ansätze zu entwickeln, um Veränderungen der synaptischen Verbindungen zu quantifizieren. Ausgehend vom Beispiel Fixierung dieses Protokoll Details, wie man Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt. Die Zahl dieser Kolokalisationen wird unter Verwendung eines Plug in Puncta Analyzer (geschrieben von Bary Wark, auf Anfrage, c.eroglu @ cellbio.duke.edu) unter dem ImageJ-Software-Plattform. Die Synapse-Assay in diesem Protokoll beschrieben, kann auf jeden Nervengewebe oder Kultur Vorbereitung, für die Sie selektiv prä-und postsynaptischen Markern angewendet werden. Diese Synapsen Assay ist ein wertvolles Werkzeug, das weit in das Studium der synaptischen Entwicklung genutzt werden kann.
Protocol
Discussion
Die Synapse oben beschriebenen Test wird im Rahmen unserer experimentellen Ziele, wobei wir vor allem Fokus auf exzitatorische Projektionen RGCs basieren, entweder in gereinigtem Kultur oder im Gehirn Abschnitt. Wir haben eine Referenz Tabelle mit Antikörpern, die gut für die Kennzeichnung Synapsen (Tabelle 1).
Diese Synapsen Test lässt sich an Synapsen bei jedem neuronalen Population oder einer anderen synaptischen Subtyp, für die es eine selektive prä-und postsynaptischen Marker zu qu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Puncta Analyzer Plug-in für Bild J von Barry Wark (aktuelle Adresse: Physion Consulting) geschrieben wurde im Labor von Ben A. Barres (Stanford University).
Finanzierung;
- Alfred P. Sloan Foundation
- Die Esther A. und Joseph Klingenstein Fund, Inc.
- Broad Biomedical Research Foundation
- Heilung für Huntington-Krankheit Initiative
Materials
| Antigen | Species | Monoclonal/Polyclonal | Vendor | Catalog Number | Dilution | Works in Culture | Works in Sections | |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 106004 | 1:750 | Y | N.D. |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 106001 | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs | VAM-PS003F | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems | 141004 | 1:1000 | Y | N.D. | |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 105002 | 1:750 | Y | N | |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 104211 | 1:500 | Y | Y | |
| Synaptophysin (C1.7.2) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 101011 | 1:500 | Y | Y | |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore | MAB5502 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB5905 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB2251 | 1:2500 | N | Y | |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) |
Mouse | Monoclonal | Affinity Bio Reagents | MA1-045 | 1:750 | Y | N |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed | 51-6900 | 1:500 | N | Y | |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 160011 | 1:500 | Y | N.D. | |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore | AB5875 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 147003 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 147 | 1:200 | Y | Y |
Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.
| Reagent | Company | Cat. No. |
| PBS | Invitrogen | 20012-027 |
| poly-d-lysine | Sigma | P6407 |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 |
| Normal Goat Serum | Gibco | 16210 |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher | BP152-5 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
| l-lysine | Sigma | L-1137 |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
| 24-well culture plate | Falcon | 35-3047 |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | — |
| Supply | Company | Cat. No. |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR Scientific | 48393241 |
| Glass slides | VWR Scientific | 48311-703 |
Referenzen
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