השימוש Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE) לפקח הפצת הלימפוציטים

1) מגיב ההתקנה 1.1) מניות CFSE פתרון לצבוע CFSE נרכש כמו carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA, SE) (MW 557.47 g / חפרפרת), בדרך כלל 25 מ"ג צלוחיות. ממיסים את 25 מ"ג ב 8.96 מ"ל DMSO לפתרון הסופי המניות של 5 מ"מ (50-100 לאחסן aliquots μL ב -20 ° C במשך כמה חודשים). CFDA, SE יגיב עם בתמיסה מימית כך קריטי, כי חשיפה כזו להימנע במהלך האחסון. 1.2) לימפוציטים בידוד לימפוציטים מן הטחול או בלוטות הלימפה מעכברים resuspend ב 1 מ"ל של מדיום תרבות (למשל RPMI) עם 5% חום מומת (HI) עוברית עגל בסרום (FCS), עם ריכוז תאים של בין 0.5 x אוקטובר 06-10 10 x 7 / mL. 2) CFSE תיוג 2.1) שגרתיות השיטה: ביסודיות resuspend תאים בנפח 1 מ"ל של מדיום ומקום בקפידה התחתון של צינור (לא הרטובות) טריים חרוטי 10 מ"ל. הנח את הצינור אופקית (באמצעות צינור אי – הרטובות תמנע 1 מ"ל תאים ההשעיה מן מרגש בטרם עת ערבוב עם פתרונות CFDA SE). בזהירות להוסיף 110 μL של PBS לחלק בלתי הרטובות של הפלסטיק בחלקו העליון של הצינור כדי להבטיח שזה לא ליצור קשר עם פתרון התא. Resuspend 1.1 μL של המניה 5 מ"מ של CFDA, SE ב 110 PBS μL. כובע במהירות את הצינור ואת המערבולת להפוך גם לקבל אחיד ומהיר ערבוב של פתרונות. שים לב כי צבע CFSE הוא בריכוז הסופי של 5 מיקרומטר, לעומת זאת, הריכוז האופטימלי ייתכן שייקבע עבור כל אצווה מוכנים, ובדקה אז כל 6 חודשים על מנת להבטיח שהוא יעיל. דגירה תאים 5 דקות בטמפרטורת החדר. שים לב כי בעת המרה של CFDA, SE כדי CFSE (ראה דיון) צבען הופך הניאון נוטה ובכך הלבנה על ידי חשיפה לאור מוגזם. לפיכך, מומלץ להגן על הצינור מן האור מנקודה זו ואילך, למשל על ידי כיסוי אותו עם רדיד אלומיניום. שטפו תאים על ידי דילול של 10 כרכים של 20 ° C PBS המכיל 5% HI FCS, sedimenting ידי צנטריפוגה XG ב 300 דקות ב 5 20 ° C ולהשאיר את supernatant. חזור על לשטוף פעמיים נוספות. 2.2) שיטה אלטרנטיבית, אשר מתאים גם מספרים התא גבוה יותר (10-30 x 10 7): הכן 2 x (10 מיקרומטר) CFDA, פתרון SE על ידי הוספת 2 μL של המניה 5 מ"מ עד 1 מ"ל של PBS ובמהירות להוסיף זה 1 מ"ל של תאים resuspended ביסודיות, אז מהר מכסה את הצינור ואת המערבולת להפוך גם לקבל אחיד מהיר ערבוב. דגירה התאים 5 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף כמו בשלבים 2.1 (ו) ו 2.1 (ז). 2.3) תאים אז יכול להיות מיושם על פרוטוקול הריבית לזירוז של חלוקת התא. תאים תווית ניתן להשתמש גם במבחנה מבחני vivo. 2.4) בסיום של assay שגשוג התאים נקצרים ונותחו על ידי cytometry הזרימה (ראו להלן דוגמאות מייצגות). 3) נציג תוצאות כדי להעריך את התפשטות לימפוציטים על ידי דילול CFSE, כדאי לדעת את הקרינה של תאים המאוחדת (כלומר מרבית הקרינה) ולא שכותרתו תאים (כלומר הקרינה מינימום). לכן, תכנון הניסוי שלך צריך לקחת פקדים אלה בחשבון. להלן דוגמאות של במבחנה מבחני vivo באמצעות CFSE למדוד CD8 + T חלוקת התא על ידי cytometry הזרימה. 3.1) בשנת גירוי חוץ גופית איור 1 מציג את הפרופילים של CFSE CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים לקולטן תא T CD8 + מהונדס OT-T אני תאים לאחר 3 ימים עם התרבות תאים דנדריטים פעמו עם כמויות שונות של OVA. CD8 + T תאים מטוהרים מן בלוטות הלימפה והטחול של OT-אני עכברים תויגו עם CFSE ו 1 x 10 5 תאים בתרבית עם 3.3 DC x 4 10. DC פעמו בו עם OVA עבור שעה 1 ב 37 ° C ורחץ לפני פעמיים לתרבות. לאחר 3 ימים, התאים בהם קוצרים ומסומן עם אנטי CD8-APC נוגדנים Hoechst 33258 ולאחר מכן נותחו על ידי cytometry זרימה (50,000 אירועים שנאספו). חיים (Hoechst 33,258 -) CD8 + תאים מוצגים. כמו שולטת, CD8 + T תאים בתרבית לבד, מראה את עוצמת CFSE של אי מחולק לתאים, בעוד התאים הלא שכותרתו מציגה את פלואורסצנציה אוטומטי של התאים ואת גבולות של חלוקות תא לזיהוי. שים לב 4 פסגות CFSE ניתן לראות בכל אחד הפאנלים בדוגמה זו, המציין כי התאים שעברו עד 3 אוגדות. 3.2) בשנת גירוי vivo איור 2 מראה את הפרופילים של CFSE CFSE שכותרתו קולטן T-OVA ספציפי תא מהונדס CD8 + OT-T לתאים אני אחרי 3 ימים in vivo in נוכחות של OVA 20 מיקרוגרם. CD8 + T תאים מטוהרים מן בלוטות הלימפה והטחול של CD45.1 congenic OT-אני עכברים תויגו עם CFSE ו 5 x 10 6 תאים iv מוזרק לווריד הזנב לרוחב של C56BL/6J (CD45.2 +) בעכברים. לאחר 2 שעות הוזרקו לעכברים iv עם 20 מיקרוגרם של OVA. לאחר 3 ימים, spleens מעכברים נאספו, הפך ההשעיה תא בודד, שכותרתו עם אנטי B220-PerCP, אנטי CD8-APC-Cy7 ואנטי CD45.1-PE-Cy7 נוגדנים Hoechst 33258 ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry זרימה (1,000,000 אירועים שנאספו). חיים (Hoechst 33,258 -) B220-תאים מוצגים בלוח השמאלי מגודרת CD8 + + CD45.1 התאים הראו בלוח הנכון. כמו שולטת, unstimulated CFSE שכותרתו CD8 + T תאים, מראה את עוצמת CFSE של אי מחולק לתאים, בעוד שאינו מסומן תאים מציגה את פלואורסצנציה אוטומטי של התאים ואת גבולות של חלוקות תא לזיהוי. שים לב כי השימוש הבדל CD45 allotypic חיוני בפתרון CD8 + T תאים שהועברו מהמחשב המארח, כפי שהם תת קטין מכלל התאים CD8 + T (הפאנל השמאלי). שים לב, רוב התאים ליפול בתוך 7 הפסגות CFSE בדוגמה זו (פאנל מימין), המציין כי התאים שעברו עד 6 חטיבות. באיור 1. היכולת של CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים קולטן T תא מהונדס CD8 + OT-I לתאי T להיענות במבחנה כדי DC פעמו עם ריכוזים שונים של OVA, הנתונים המוצגים להיות אחרי תרבות ימים 3. הערה האוכלוסייה הלא מחולק של CD8 + T תאים בהעדר אנטיגן (אור היסטוגרמה אפור) ו פלואורסצנציה אוטומטי של האוכלוסייה הלא מסומן (היסטוגרמה אפור כהה). איור מתאר CD8 + תאי T יש לחלק 1-3 פעמים על בסיס דילול CFSE פסגות, עם יותר תאים T חלוקת על ריכוזי אנטיגן גבוה יותר. איור 2. היכולת של CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים קולטן T תא מהונדס CD8 + OT-I לתאי T, כאשר הועבר adoptively לעכברים C57BL / 6 כדי להגיב OVA, הנתונים המוצגים 3 ימים לאחר העברת המאמצת פאנל שמאל:. CD8 +, CD45. 1 + 1 תאים OT-T בעכברים הנמען. פאנל ימין: התפשטות פרופיל CFSE. הערה האוכלוסייה הלא מחולק של CD8 + T תאים בעכברים הנמען לא מקבל אנטיגן (אור היסטוגרמה אפור) ו פלואורסצנציה אוטומטי של אי שכותרתו לימפוציטים (היסטוגרמה אפור כהה). איור מתאר CD8 + תאי T יש לחלק 1-6 פעמים על בסיס דילול CFSE פסגות. איור 3. ייצוג של אירועים מולקולריים שונים המתרחשים במהלך תיוג של תאים עם carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA, SE). לפרטים של התהליך לראות טקסט דיון. הערה: "CFSE" ראשי תיבות הגנרית, לא CFDA, SE, המשמש לתיאור מגיב תיוג תיוג את ההליך באופן כללי. איור המבוסס על פאריש 4.