非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー
Summary
このプロトコルは、生きている齧歯類の脳の特定領域に遺伝子構築物の送達の非ウイルス方法を説明します。方法は、プラスミド調製、マイクロピペットの製造、新生児ラット子犬手術、コンストラクトのマイクロインジェクション、および構成されています<em> in vivoで</em>エレクトロポレーション。
Abstract
トランスジェニック動物の作成 は、 生体内で目的の遺伝子の機能を研究する上で標準的なアプローチです。しかし、多くのノックアウトまたはトランスジェニック動物は、改変された遺伝子が発現したり、生物全体に削除されるような場合に実行可能ではありません。また、代償機構の様々な、しばしばそれが困難な結果を解釈すること。補償効果はどちらのタイミング遺伝子発現またはトランスフェクトされた細胞の量を制限することによって軽減することができます。
出生後の非心室マイクロインジェクションの方法および in vivoエレクトロポレーションでは、直接新生児げっ歯類の脳への関心の小さな領域への遺伝子、siRNAや色素分子の標的送達することができます。従来の心室の注入法とは対照的に、このメソッドは非遊走細胞の種類のトランスフェクションすることができます。ここで説明する方法によりトランスフェクトされた動物は、in vivoイメージングや急性脳スライスの電気生理学的実験で、例えば、二光子のために、使用することができます。
Protocol
1。はじめトランスジェニック動物の作成 は、動物1を生きているのとセル4のプロパティを操作するためだけでなく、病気のメカニズム2,3を解明するための遺伝子機能の研究の強力な方法です。しかし、手順はこのように、ウイルス注射5、エレクトロポ6のと子宮内エレクトロポレーション7,8 における新生…
Discussion
生きている齧歯類の脳への遺伝子送達の方法は、当生後エレクトロ6について、最近では、 子宮内エレクトロポレーション7,8,11,12 のために確立されています。しかし、これらの方法はいくつかのアプリケーションのために制限されることがありますプラスミドDNA、の脳室内注入に基づいています。例えば、これらのメソッドは、海馬、また皮質アストロサイトな…
Acknowledgements
私たちは、ビデオのサウンドトラックの録音、CAG – EGFPプラスミド調製のための3DアニメーションとピーターBlaesse用イワンMolotkovのヘルプはエカテリーナKarelinaに感謝。
作業は、フィンランドの国際的なモビリティ、フィンランド文化財団とフィンランドアカデミーのセンターからの補助金によって支えられている。
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instruments | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | FST | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing microelectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson Medical | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | FST | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
Referenzen
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- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).
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Gene DeliveryPostnatal Rat BrainNon-ventricularPlasmid InjectionElectroporationTransgenic AnimalsGene Of InterestKnockout AnimalsCompensatory MechanismsGene Expression TimingTransfected CellsMicroinjectionIn Vivo ElectroporationTargeted DeliverySiRNADye MoleculesNewborn Rodent BrainNon-migratory Cell TypesTwo-photon In Vivo ImagingElectrophysiological Experiments
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Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).