1. L'importance de comptage cellulaire Cellules de comptage est une étape nécessaire mais fastidieux pour en culture de cellules in vitro. Concentrations cellulaires compatibles assurer la reproductibilité et la précision expérimentale. Numérations cellulaires sont importantes pour la surveillance de la santé des cellules et le taux de prolifération, d'évaluer l'immortalisation ou la transformation, l'ensemencement des cellules d'ultérieures expériences, la transfection ou infection, et la préparation des tests cellulaires. Malgré le besoin de rapidité et de précision dans le comptage de cellules, 71% des 400 chercheurs interrogés comptent cellules en utilisant un hématimètre. Bien hemocytometry est peu coûteux, il est laborieux et soumis à des biais d'utilisateur et l'utilisation abusive, ce qui entraîne compte inexactes. Sources d'erreur dans hemocytometry incluent: la distribution inégale des cellules dans l'échantillon, trop ou trop peu de cellules dans l'échantillon, les décisions subjectives quant à savoir si une cellule donnée relève du domaine défini comptant, la contamination de l'hématimètre, l'utilisateur à utilisateur de variation , et la variation du taux de remplissage de hémocytomètre. Pour remédier à l'ennui associé à un comptage manuel, 29% des chercheurs compter les cellules en utilisant des dispositifs de comptage automatique de cellules. Toutefois, pour la plupart des chercheurs, le prix associé à ces grands instruments de paillasse est un obstacle à leur utilisation. Le compteur de cellules sceptre est un dispositif automatisé de poche qui offre l'automatisation et la précision du comptage Coulter, à un coût relativement faible. Le système utilise le principe Coulter de détection de particules à base d'impédance dans un format miniaturisé utilisant une combinaison de matériel analogique et numérique pour la détection, le traitement du signal, de stockage de données, et l'affichage graphique. Le capteur à usage unique est conçu avec une microfabriqué, cellule de détection de zone qui permet la discrimination par la taille des cellules et le volume des cellules au sous-micron et sous-picolitres résolution. Avec une précision améliorée de manutention de liquides canaux et de l'électronique, le compteur de cellules Sceptre affiche graphiquement des statistiques de la population de cellules sous forme d'histogramme. 2. Préparation d'une suspension monocellulaire pour le comptage Pour utiliser le compteur de cellules Sceptre, commencez par dilution d'une suspension cellulaire unique de cellules, en tampon phosphate salin. Une concentration de 10,000-500,000 cellules par mL est optimale. Transférer 100 ul de cellules diluées à un tube de 1,5 ml. 3. Exécution Comptage des cellules en utilisant le Sceptre Mettez le compteur de cellules Sceptre en appuyant sur le commutateur à bascule sur le dos de l'appareil et d'attendre les instructions apparaissent à l'écran. Lorsque vous êtes invité, joignez un capteur à la fin de l'unité sceptre avec le panneau électrode de détection face vers l'avant de l'instrument. Sceptre capteurs se composent d'une chambre d'échantillonnage moulé avec précision, avec une zone de détection électronique et intégré la cellule de détection des électrodes. Les capteurs permettent de discriminer la taille des cellules au sous-micron résolution, et le volume des cellules au sous-picolitres résolution. D'ingénierie de capteurs compatibles, assure que les volumes d'échantillon égales sont comptés et les mesures de taille précises sont faites. Une fois que le capteur est fixé, effectuer chaque étape du processus de comptage selon les instructions à l'écran comme suit: Lorsque l'écran affiche "Maintenez enfoncé le piston pour commencer," appuyer sur le piston. L'écran sera alors lire "immerger le capteur." Immerger le capteur dans la solution de suspension de cellules et libérer le piston pour aspirer la suspension cellulaire dans le capteur. Le piston agit comme un signal électrique et va attirer l'échantillon, plus le volume mort dans le capteur. La vitesse ou la précision de plonger n'importe pas tant le fait avec pipetage. Ce processus prendra plusieurs secondes. Lorsque vous êtes prêt, l'instrument émet un bip et "échantillon chargé" sera affiché sur l'écran. Une fois l'échantillon est chargé dans le capteur, il est tiré à travers la zone de détection pour évaluer la taille des cellules et le volume des cellules, puis à travers les microcanaux. Une fois 50 ul d'échantillon est compté le capteur indique l'instrument pour arrêter le comptage. Après le dépouillement terminé, l'écran de l'instrument va lire "dénombrement complet. S'il vous plaît supprimer de capteurs et les jeter." Suivez l'invite, retirez et jetez la sonde. L'instrument va alors afficher un histogramme de la taille des cellules ou de diamètre sur son écran ainsi que la concentration de cellules par mL. 4. Analyse des données Après le décompte est terminé et l'histogramme est affiché sur l'instrument, appliquer portes en poussant le bouton à bascule. Sélectionnez «gating auto" ou "dernière utilisation" soit automatiquement la porte en fonction du profil de l'histogramme, ou d'utiliser les portes de l'comptage précédent. Indépendamment de la sélection, les portes peuvent être déplacés manuellement pour affiner les données. Poussez le bouton à bascule de nouveau pour sélectionner la porte à gauche et à faire défiler laggle pour déplacer la grille comme désiré. Ensuite, appuyez sur la bascule à nouveau pour activer la porte de droite et faites défiler la bascule de placer la porte de droite. Cliquez à nouveau, une nouvelle concentration de cellules, le volume moyen des cellules et le diamètre sera affichée. La bascule peut également être déplacé de chaque côté pour basculer l'affichage entre les date, heure, taille moyenne de la cellule, et le volume cellulaire moyen. Jusqu'à 72 histogrammes peuvent être stockées sur l'appareil lui-même. Pour télécharger les données vers un ordinateur personnel, fixez l'appareil via le port USB du câble sur l'écran. Sur le PC, double-cliquez sur l'application du logiciel Sceptre pour lancer le logiciel puis cliquez sur "Connect". Tous les chiffres seront automatiquement le port pour le logiciel. Le logiciel d'application Sceptre affiche l'histogramme détaillant la répartition de la population de la culture en volume ou en diamètre. Les fichiers téléchargés peuvent ensuite être exportées vers Microsoft Excel, lorsque les données brutes seront affichés dans les bacs des diamètres de cellules spécifiée ou des volumes de cellules. 5. Les résultats représentatifs Dix-neuf lignées cellulaires différentes ont été préparées pour le comptage et théoriques concentrations de départ sont déterminées en utilisant un compteur Coulter. Ces suspensions cellulaires ont ensuite été dilués pour obtenir des suspensions cellulaires à des concentrations cellulaires théorique. Le compteur de cellules Sceptre a ensuite été utilisée pour déterminer les concentrations cellulaires. La figure 1 montre que les dilutions 5 ont été mesurées pour cinq lignées cellulaires représentatives ainsi que la concentration cellulaire théorique. Le haut degré de linéarité comme indiqué par les valeurs de R2, démontre que le comptage sceptre est une méthode fiable pour les lignées cellulaires testées, dans une large gamme de fonctionnement linéaire. La précision relative globale de comptage sceptre est démontré dans la figure 2, dans lequel les données obtenues du comptage Sceptre sont comparés avec chiffres obtenus de comptage Coulter. Le journal de la numération cellulaire sceptre est comploté contre le journal de la numération Coulter, et montre que, dans toutes les lignées cellulaires testées, compte Sceptre correspondre aux chiffres de Coulter. Comtes de 19 lignées cellulaires ont été effectuées en utilisant un compteur Coulter Z2, le compteur de cellules Sceptre, un compteur automatisé basé sur la vision tels que Vi-Cell ou d'un système innombrables, et un hemocytemeter. Comptages ont été effectués conformément aux instructions du fabricant, en utilisant la même cellule de départ de suspension et des dilutions identiques. Les résultats présentés dans la figure 3 montrent que les concentrations mesurées par la cellule Sceptre compter correspondent étroitement les concentrations cellulaires théorique avec une grande linéarité. Le coefficient de variation pour cent, ou CV, a été calculée pour chaque dilution de chaque lignée cellulaire pour chaque système de comptage. La figure 4 montre les CV% en moyenne plus de 19 lignées cellulaires à l'égard de la concentration des cellules et la méthode de comptage. Dans la plage de fonctionnement, le compteur de cellules sceptre est plus précis que le comptage hémocytomètre vision fondée, en affichant plus petits écarts-types et les petits coefficients de variation moyen. Compter sceptre est dix fois plus vite que hemocytometry et plus vite que d'autres compteurs automatiques aussi. Dans la figure 5, SF9, MCF7, et les cellules HEK293 ont été comptés en utilisant les méthodes décrites dans cette vidéo. Le temps moyen nécessaire pour mesurer la concentration cellulaire a été enregistré. Notez que hemocytometry a été réalisée qu'une seule fois par échantillon. Sceptre fait des mesures basées sur la taille des cellules. Ainsi tout changement dans la morphologie cellulaire peuvent être capturés dans l'histogramme. Cultures santé à afficher une cloche en forme de belle distribution gaussienne, tandis que les cellules insalubres, Lyse, et provoquer un changement dans l'histogramme vers la gauche (figure 6, panneau de gauche). De même, quand une population de 50% de cellules mortes ont été mélangés avec 50% des cellules vivantes, des changements ont également été observées histogramme (figure 6, panneau de droite).
