Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

1. Metodología de imágenes Derretir la glicerina gelatina en un baño de agua a 55 ° C grados durante 20-30 minutos hasta que se convierte en un líquido homogéneo. Remolino, pero no agitar el frasco para evitar la formación de burbujas. Mientras que la gelatina se derrite, aplique una fina capa de glicerina con una Kimwipe en un portaobjetos de vidrio limpio (opcional). Pipeta de 1 a 1,5 ml de glicerina derretido jalea con un P1000 corte punta de la pipeta en la superficie de la diapositiva para crear una primera capa fina. Pipeta con cuidado para evitar burbujas. Deje que la gelatina solidifique durante 5 minutos sobre una superficie horizontal, a continuación, colocar la placa a -20 ° C durante 5 minutos y proceder a la alineación del embrión. Otra forma es cubrir el portaobjetos con Saran Wrap y colocarlo a 4 ° C durante un máximo de 5 días. Pipeta una gota de embriones teñidos en 70% de glicerol / PBS u otro Antifade base de glicerol-medios de montaje (por ejemplo, o Slowfade Vectashield) en el lado de la cama de gelatina. Comenzar antes de la alineación de los embriones por separado a la transferencia de la caída de la superficie de la gelatina. Transferencia utilizando una aguja hipodérmica inclinada, con el lado inclinado como una cuchara. Alrededor de colocar los embriones a lo largo de 2 a 3 columnas. Si un embrión se queda atascado en la aguja, se revuelve en el desplegable que contiene los otros embriones para liberarlo. No pierdas el tiempo con cuidado la alineación en este momento. Deje algo de espacio entre las columnas. Alinear los embriones por deslizamiento en horizontal en el medio de gelatina con la ayuda de la aguja hipodérmica. Mientras desliza, orientar las cabezas y las colas en la misma dirección. Hacerlos paralelos entre sí a lo largo de la columna. Eliminar el exceso de glicerol PBS izquierda como un camino con un pedazo de Kimiwipe trenzado. Nota: El exceso de glicerol hará que los embriones que se suelta encerrado dentro de gel, lo que resulta en la separación de las dos capas de gelatina, por lo que es difícil de cortar y montar. Por el contrario, la eliminación de glicerol demasiado se seca y se aplanan embriones. Utilice una punta amarilla corte para esparcir una capa delgada de gel sobre los embriones (50-150 l, dependiendo de cuántos fueron alineados). Lugar de diapositivas en congelador a -20 ° C durante 10-20 minutos o almacenar a 4 ° C durante la noche. Asegúrese de que el gel está completamente rígido antes de cortar. De lo contrario, el bloque de embriones será muy difícil de extirpar. Los mejores resultados se obtienen para el corte al día siguiente. Bajo un microscopio de disección, utilice una hoja de afeitar para cortar completamente a través de la jalea en ambos lados de los embriones alineados. Mantenga la hoja de afeitar en un ángulo de 90 ° para realizar cortes rectos. Los cortes deben quedar muy cerca de los polos anterior y posterior de los embriones para evitar el exceso de gel que puede obstruir la imagen. Añadir 100-200 L de PBT frío (4 ° C, PBS 0,1% Tween 20) al lado de los recortes y cuidadosamente raspe la gelatina entre los embriones con una espátula. Nota: El detergente en PBT ayuda a la eliminación de la jalea de la diapositiva sin dañar los embriones. Usando una aguja, la transferencia del bloque de gelatina con embriones incrustado en un portaobjetos limpio para cortar más. Cortar los bloques más pequeños con embriones 5-7. Use PBT para moverse con facilidad alrededor de la manzana de gelatina. Por otra parte, colocar el bloque en una superficie de vidrio seco para dejar que se adhieren a los cristales, lo que crea más estabilidad, precisamente por el recorte de la jalea, si es necesario. Voltear vertical los embriones incrustados en la jalea con la ayuda de una cuchilla de afeitar y una aguja. Para la visualización al microscopio, proceder con cualquiera de los dos pasos siguientes, dependiendo del tipo de microscopio están siendo utilizados. Microscopio invertido: el lugar terminó bloques embrión en un cubreobjetos de largo, con embriones en una posición vertical. Asegúrese de que la parte del embrión con la menor cantidad de jalea estará en contacto más estrecho con el objetivo. Microscopio vertical: hacer dos pilas con cuatro n º 1 cubreobjetos pegados con pegamento que se utiliza como "apoyo" y colocar el bloque de embriones de glicerol en el medio de la "apoya". Puente de las pilas con un cubreobjetos de largo. Para el análisis confocal, comprobar la distancia de trabajo de los objetivos que se utilizarán para determinar si usted puede imaginar todo el camino a través del embrión o sólo parcialmente. Por ejemplo, D. embriones melanogaster han ~ 0,55 mm de longitud y puede ser enteramente imágenes utilizando un Zeiss 20x Plan-Apo o un objetivo de 40x LD Neo-Fluor. El siguiente sitio tiene información sobre los objetivos Zeiss disponible y te ofrece la opción de buscar objetivos, de acuerdo a las distancias de trabajo: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2. Resultados representante Debido a que los embriones se mantienen intactas, este método puede ser usado para tomar mediciones precisas del tamaño del embrión y las distancias entre los patrones de expresión génica. En la Figura 1, se muestra una etapa de blastodermo embriones teñidos con la tinción nuclear con DAPI (azul), anti-proteína dorsal (rojo), el ARNm sog (amarillo) y ARNm sna (verde). Proces morfológicasses, como la invaginación del mesodermo (Figura 2A, B) y la migración de las células del mesodermo (Figura 3 y 4) también se pueden visualizar con este método. Z-posiciones diferentes a lo largo del eje DV se puede obtener al cambiar el plano focal, como se muestra en las figuras 2-4. Figura 1. Vertical rebanada óptica de un embrión intacto en la etapa blastodermo. Doble tinción de ARNm y proteínas. MRNAs objetivo en las sondas in situ (SOG y SNA) y la proteína manchada por el anticuerpo primario (anti-dorsal) se indican en la figura. DAPI se utiliza para etiquetar los núcleos. Tenga en cuenta que la expresión de la SOG y la SNA se encuentran en el citoplasma apical, mientras que la expresión de la dorsal es de origen nuclear. Señales fuertes de las transcripciones sog nacientes que se encuentran en los núcleos también se puede ver en este aumento. Figura 2. Imagen vertical de un embrión intacto gastrulating. Sondas de ARNm utilizados y sus respectivos colores se indican en la figura. A) Tenga en cuenta que en esta etapa, tres genes manchado con la misma fluor (SCN, sog y DPP, en verde), se expresan en dominios separados espacialmente. El mesodermo invaginación expresa SNA, la capa de neuroblast expresa ind y el ectodermo expresa DPP, mientras que la expresión sog todavía está presente en las regiones ventrales del sistema nervioso. B) En un plano más profundo confocal del embrión mismo, tomamos nota de la base de la invaginación del mesodermo sna expresa con fuerza, pero su región apical expresa los niveles más bajos. Figura 3. Imagen vertical de un embrión intacto con la banda de germen extendido sog ARN (amarillo);. Caracol, ind y mRNAs dpp (verde), la proteína dorsal (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). A) del plano focal cerca de la cabeza del embrión. B) Otro plano focal en la región del tronco del embrión mismo. Tenga en cuenta la masa de las células del mesodermo lateral antes de la migración (en comparación con la Figura 4), situada cerca de la línea media ventral en ambos lados de un embrión de germen de banda extendida. Neuroblastos delaminación están marcados en verde (ind y SNA). Figura 4. Imagen vertical de un embrión intacto durante la extensión de la banda de germen de sog ARN (amarillo);. Caracol, ind y mRNAs dpp (verde), la proteína dorsal (rojo). A) Nota de la neuroblastos delaminación del epitelio (flecha), teñido, tanto para ind y sna en esta etapa (verde). Tenga en cuenta también la expresión restringida de sog a la línea media ventral (amarillo). Expresión de dpp en este momento se puede ver en las caras laterales del embrión (asterisco). B) Sección óptica en el mismo embrión se muestra en A cerca del final de la longitud del embrión, que corresponde a mediados de la región posterior. Las células de la línea media ventral se tiñen para SOG.