Imagerie verticale de<em> Drosophila</em> Embryons

1. Méthodologie d'imagerie Faire fondre la gelée de glycérine dans un bain d'eau à 55 ° C degrés pendant 20-30 minutes jusqu'à ce qu'elle devienne un liquide homogène. Swirl, mais ne secouez pas la bouteille pour éviter la formation de bulles. Alors que la gelée fond, appliquer une fine couche de glycérol à l'aide d'un Kimwipe sur une lame de verre propre (en option). Pipette de 1 à 1,5 ml de glycérine fondue gelée à l'aide d'une pointe de pipette P1000 coupe sur la surface de la diapositive pour créer une première couche mince. Pipeter avec précaution pour éviter les bulles. Laissez la gelée de solidifier pendant 5 min sur une surface horizontale, puis placer la lame à -20 ° C pendant 5 min et procéder à l'alignement embryon. Alternativement, couvrir la lame avec le Saran Wrap et le placer à 4 ° C pendant 5 jours. Introduire à la pipette une petite goutte d'embryons colorés dans du glycérol 70% / PBS ou autres Antifade glycérol à base de milieu de montage (par exemple Slowfade ou Vectashield) sur le côté de la litière gelée. Commencez pré-alignement des embryons parindividuellement les transférer à partir du menu à la surface gelée. Transférez-les à l'aide d'une aiguille hypodermique inclinée, en utilisant le côté incliné comme une cuillère. Environ placer les embryons ainsi que 2 à 3 colonnes. Si un embryon se coince dans l'aiguille, remuer dans la liste déroulante contenant les embryons d'autres pour le libérer. Ne perdez pas de temps avec soin en les alignant à ce stade. Laissez de l'espace entre les colonnes. Aligner les embryons en les faisant glisser horizontalement sur le support gelée à l'aide de l'aiguille hypodermique. Tout en faisant glisser, orienter les têtes et les queues dans la même direction. Rendre parallèles les uns aux autres le long de la colonne. Enlever l'excès de glycérol PBS laissé comme une traînée avec un morceau de Kimiwipe torsadée. Remarque: le glycérol en excès entraîne des embryons pour être lâchement enfermée à l'intérieur du gel, ce qui entraîne la séparation des couches de gelée deux, ce qui rend difficile à découper et à monter. En revanche, la suppression de glycérol trop de sécher et aplatir embryons. Utiliser un embout de coupe jaune pour diffuserune fine couche de gelée sur les embryons (50-150 ul, selon la façon dont beaucoup ont été alignés). Placer la lame dans congélateur à -20 ° C pendant 10-20 min ou le stocker à 4 ° C pendant la nuit. Assurez-vous que la gelée est complètement rigide avant de couper. Sinon, le bloc d'embryons sera très difficile à exciser. Les meilleurs résultats sont obtenus pour la coupe le lendemain. Sous un microscope à dissection, utiliser une lame de rasoir pour couper complètement à travers la gelée sur les deux côtés des embryons alignés. Maintenez la lame de rasoir à un angle de 90 ° pour réaliser des coupes droites. Les coupes doivent être faites très près des pôles antérieur et postérieur de l'embryon pour éviter les excès de gelée qui peuvent entraver l'imagerie. Ajouter 100-200 ul de froid PBT (4 ° C, PBS + 0,1% Tween 20) à côté des coupes et soigneusement gratter la gelée entre les embryons à l'aide d'une spatule. Remarque: Le détergent en PBT permet l'élimination de la gelée de la glissière sans endommager les embryons. L'utilisation d'un e aiguille, transferte bloc de gelée avec des embryons intégrés à une lame propre pour couper davantage. Couper les petits blocs avec des embryons 5-7. Utilisez PBT de se déplacer facilement autour du bloc de gelée. Sinon, placez le bloc sur une surface de verre sec pour laisser fixent sur le verre, ce qui crée plus de stabilité pour justement couper la gelée, le cas échéant. Retourner verticalement les embryons noyées dans la gelée à l'aide d'une lame de rasoir et une aiguille. Pour la visualisation au microscope, soit procéder à une des deux étapes ci-dessous, en fonction du type de Pied pour microscope utilisé. Microscope inversé: fini les blocs d'embryons lieu sur une lamelle de long, avec des embryons dans une position verticale. Faire en sorte que le côté de l'embryon avec le moins de gelée sera en contact plus étroit avec l'objectif. Microscope droit: faire deux piles de quatre lamelles collées # 1 avec de la superglue pour être utilisé comme "supports" et placez le bloc d'embryons dans du glycérol entre les «supports». Combler les piles à l'aide d'unlamelle longue. Pour l'analyse confocale, vérifiez la distance de travail des objectifs à utiliser pour savoir si vous pouvez l'image tout au long de l'embryon ou seulement partiellement. Par exemple, D. embryons ont melanogaster ~ 0,55 mm de longueur et peut être entièrement imagé en utilisant un Zeiss 20x plan-Apo ou un 40x LD Neo-Fluor objectif. Le site suivant contient des informations sur les objectifs Zeiss disponibles et vous donne la possibilité aux objectifs de recherche en fonction de distances de travail: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2. Les résultats représentatifs Parce que les embryons sont laissés intacts, cette méthode peut être utilisée pour effectuer des mesures précises de la taille des embryons et les distances entre les profils d'expression génique. Dans la figure 1, nous montrons une embryons au stade blastoderme colorées avec du DAPI tache nucléaire (bleu), la protéine anti-dorsale (rouge), l'ARNm sog (jaune) et l'ARNm sna (vert). Proces morphologiques session, comme l'invagination du mésoderme (Figure 2A, B) et la migration des cellules mésodermiques (figure 3 et 4) peuvent également être visualisés à l'aide de cette méthode. Différentes positions Z le long de l'axe DV peut être obtenue en modifiant le plan focal, comme représenté sur les figures 2-4. Figure 1. Upright tranche optique d'un embryon intact au stade blastoderme. Double coloration pour l'ARNm et de protéines. ARNm cibles pour sondes in situ (sog et sna) et colorées par la protéine anticorps primaire (anti-dorsale) sont indiqués sur la figure. DAPI est utilisé pour marquer les noyaux. Notez que l'expression de sog et sna sont situés dans le cytoplasme apical, alors que l'expression de la dorsale est d'origine nucléaire. Des signaux forts de transcriptions SOG naissantes qui sont situés dans les noyaux peuvent aussi être vus à ce grossissement. 2175fig2.jpg "alt =" Figure 2 "/> Figure 2. Imagerie verticale d'une sonde d'ARNm intacts gastrulating embryon. Utilisés et leurs couleurs respectives sont indiquées sur la figure. A) A noter que dans cette étape, trois gènes colorées avec la même fluor (sna, sog et dpp, en vert), sont exprimés dans des domaines séparés dans l'espace. Le mésoderme invagination exprime sna, la couche de neuroblastes exprime salle et l'ectoderme exprime dpp, tandis que l'expression sog est toujours présente dans les régions ventrales du système nerveux. B) Dans un plan plus profond confocale de l'embryon même, nous notons la base du mésoderme invagination exprime fortement sna, mais sa région apicale exprime des niveaux inférieurs. Figure 3. Imagerie verticale d'un embryon intact avec bande germe étendu sog ARN (jaune);. Escargot, salle et dpp </em> ARNm (vert), la protéine dorsale (rouge). Les noyaux ont été colorées avec du DAPI (bleu). A) à plan focal près de la tête embryon. B) Un autre plan focal dans la région du tronc de l'embryon même. Noter la masse de cellules mésodermiques avant la migration latérale (comparer à la figure 4) se trouvant à proximité de la ligne médiane ventrale sur les deux côtés d'un embryon de germe de bande étendue. Neuroblastes délamination sont marqués en vert (ind et sna). Figure 4. Imagerie verticale d'un embryon intact pendant extension de bande germe sog ARN (jaune);. Escargot, salle ARNm et DPP (vert), la protéine dorsale (rouge). A) Notez les neuroblastes délamination de l'épithélium (flèche), teinté à la fois pour salle et sna à ce stade (vert). On notera également l'expression restreinte de SOG à la ligne médiane ventrale (jaune). L'expression de dpp à ce stade peut être vu sur les côtés latéraux del'embryon (astérisque). B) l'article optique dans l'embryon même représentée en A proximité de l'extrémité de la longueur de l'embryon, qui correspond à la mi-postérieur région. Les cellules sont colorées ligne médiane ventrale pour sog.