Imagem vertical de Drosophila Os embriões

1. Metodologia de imagens Derreter a glicerina em uma geléia de 55 ° C banho de água grau por 20-30 minutos até que se torne um líquido homogêneo. Redemoinho, mas não agitar o frasco para evitar a formação de bolhas. Enquanto a gelatina derrete, aplique uma camada fina de glicerol usando um Kimwipe em uma lâmina de vidro limpa (opcional). Pipeta mL 1-1,5 de glicerina derretida geléia usando um corte de ponta da pipeta P1000 na superfície da lâmina para criar uma camada fina em primeiro lugar. Pipeta com cuidado para evitar bolhas. Deixe a gelatina solidificar por 5 min em uma superfície horizontal, em seguida, coloque o slide a -20 ° C por 5 min e proceder ao alinhamento do embrião. Alternativamente, cobrir a lâmina com Saran Wrap e coloque-a 4 ° C por até 5 dias. Pipetar uma pequena gota de embriões manchada em glicerol 70% / PBS ou outros Antifade glicerol baseada meios de montagem (por exemplo, ou Slowfade Vectashield) no lado da cama de geléia. Começar a pré-alinhamento dos embriões por transferi-los individualmente a partir da queda para a superfície da geléia. Transferi-los usando uma agulha hipodérmica inclinada, usando o lado inclinado como uma colher. Cerca de colocar os embriões ao longo de 2-3 colunas. Se um embrião fica preso na agulha, mexa na gota contendo os embriões outros para liberá-lo. Não perca tempo alinhando-as com cuidado neste momento. Deixe algum espaço entre as colunas. Alinhar os embriões deslizando-los horizontalmente no meio de geléia com o auxílio da agulha hipodérmica. Enquanto desliza, orientar o cara e coroa na mesma direção. Torná-los paralelos um ao outro ao longo da coluna. Remover o excesso de glicerol PBS esquerda como uma trilha com um pedaço de Kimiwipe torcida. Nota: glicerol em excesso causará embriões para ser vagamente envolto em gel, resultando na separação das duas camadas de geléia, tornando-o difícil de cortar e montar. Por outro lado, a remoção de glicerol demais vai secar e alisar os embriões. Use uma ponta de corte amarelo para espalhar uma fina camada de geléia sobre os embriões (50-150 mL, dependendo de quantas foram alinhados). Slides lugar no freezer -20 ° C por 10-20 min ou guarde-a 4 ° C durante a noite. Certifique-se que a geléia é completamente rígida, antes de cortar. Caso contrário, o bloco de embriões será muito difícil especiais de consumo. Os melhores resultados são obtidos para o corte no dia seguinte. De acordo com um escopo de dissecação, use uma lâmina de barbear para cortar completamente através da geléia de ambos os lados dos embriões alinhados. Segure a lâmina de barbear em um ângulo de 90 ° para fazer cortes retos. Os cortes devem ser feitos muito perto dos pólos anterior e posterior dos embriões para evitar o excesso de geléia que pode obstruir imagem. Adicionar 100-200 mL de frio PBT (4 ° C, PBS 0,1% Tween 20) próximo aos cortes e com cuidado raspe a gelatina entre os embriões usando uma espátula. Nota: O detergente em PBT ajuda a remoção da geléia a partir do slide sem danificar embriões. Usando uma agulha, transferir o bloco de geléia com embriões incorporados a um slide limpa para cortar ainda mais. Cortar blocos menores com embriões 5-7. Use PBT facilmente mover o bloco de gelatina. Alternativamente, coloque o bloco sobre uma superfície de vidro seco para deixá-lo ligar para o vidro, o que gera mais estabilidade para cortar precisamente a geléia, se necessário. Virar na vertical os embriões embutido na geléia com o auxílio de uma lâmina de barbear e uma agulha. Para visualização no microscópio, prosseguir com qualquer uma das duas etapas abaixo, dependendo do tipo de microscópio estar sendo usado. Microscópio invertido: lugar terminou blocos de embrião para uma lamela de comprimento, com embriões em posição vertical. Verifique se o lado do embrião com a menor quantidade de geléia estará em contato mais próximo com o objectivo. Microscópio vertical: fazer duas pilhas com quatro # 1 lamínulas coladas com super cola para ser usado como "suporte" e colocar o bloco de embriões em glicerol entre as "suporta". Ponte das pilhas usando uma lamela de comprimento. Confocal para análise, verificar a distância de trabalho dos objectivos a ser usado para descobrir se você pode imaginar todo o caminho através do embrião ou apenas parcialmente. Por exemplo, D. embriões têm melanogaster ~ 0,55 milímetros de comprimento e pode ser inteiramente fotografada usando uma lente 20x Plano de Apo-ou 40x LD objetivo Neo-Fluor. O site a seguir tem informações sobre os objectivos Zeiss disponíveis e lhe dá a opção de pesquisar os objectivos de acordo com distâncias de trabalho: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2. Resultados representante Porque os embriões são deixados intactos, este método pode ser usado para fazer medições precisas de tamanho do embrião e as distâncias entre os padrões de expressão gênica. Na Figura 1, mostramos uma embriões blastoderma estágio manchadas com o DAPI nuclear mancha (azul), anti-dorsais proteína (vermelho), mRNA sog (amarelo) e mRNA sna (verde). Proces morfológicasses, como a invaginação do mesoderma (Figura 2A, B) e migração das células mesodérmica (Figura 3 e 4) também pode ser visualizado utilizando este método. Diferentes posições-Z ao longo do eixo DV podem ser obtidas alterando o plano focal, como mostrado nas Figuras 2-4. Figura 1. Vertical óptico fatia de um embrião intacto em estágio blastoderma. Coloração duplo mRNA e proteína. MRNAs alvo para sondas em situ (sog e sna) e proteína manchada pelo anticorpo primário (anti-Dorsal) são indicadas na figura. DAPI foi usado para rotular os núcleos. Note-se que a expressão de sog e sna estão localizados no citoplasma apical, enquanto a expressão de dorsais é nuclear. Sinais fortes de transcrições sog nascentes que estão localizadas em núcleos também podem ser vistos sob esta ampliação. Figura 2. Testes de imagem na vertical de um embrião intacto gastrulating. MRNA utilizados e suas respectivas cores são indicadas na figura. A) Note-se que nesta fase, três genes corados com fluor mesmo (sna, sog e dpp, em verde), são expressos em domínios separados espacialmente. A mesoderme invaginante expressa sna, a camada de neuroblastos expressa ind eo ectoderma expressa dpp, enquanto expressão sog ainda está presente nas regiões ventral do sistema nervoso. B) Em um plano mais profundo confocal do embrião mesmo, notamos a base do mesoderma invaginante fortemente expressa sna, mas a sua região apical expressa níveis mais baixos. Figura 3. Imagem na vertical de um embrião intacto com a banda de germe estendida sog RNA (amarelo);. Caracol, ind e mRNAs dpp (verde), proteína dorsais (vermelho). Núcleos foram corados com DAPI (azul). A) plano focal perto da cabeça do embrião. B) Outro plano focal na região do tronco de embrião. Nota massa de células antes da migração mesodérmica lateral (compare a Figura 4) deitado próximo à linha média ventral em ambos os lados de um embrião de germe de banda estendida. Neuroblastos delaminação são rotulados em verde (ind e sna). Figura 4. Imagem na vertical de um embrião intacto durante a extensão banda germe sog RNA (amarelo);. Caracol, ind e mRNAs dpp (verde), proteína dorsais (vermelho). A) Observe o neuroblastos delaminação do epitélio (seta), manchado tanto para ind e sna nesta fase (verde). Note-se também a expressão restrito de sog à linha média ventral (amarelo). Expressão de dpp nesta fase pode ser visto em laterais do embrião (asterisco). B) seção Optical no embrião mesmo mostrado na A perto do final do comprimento do embrião, o que corresponde a mid-posterior região. As células da linha média ventral estão manchadas de sog.