直立成像果蝇胚胎

1。成像方法在55 ° C度为20-30分钟水浴融化甘油，果冻，直到它变成一个同质的液体。漩涡，但不摇瓶，以避免形成泡沫。 虽然果冻的融化，适用于使用一个干净的玻片上（可选）一个Kimwipe一层薄薄的甘油。 移液器1至1.5毫升溶化甘油果冻上使用的幻灯片的表面削减P1000的枪头，创建一个薄的第一层。小心吸取试剂，以避免气泡。 让果冻固化5分钟一个水平的表面上，然后放置在-20 ° C 5分钟的幻灯片，并进行胚胎对齐。另外，用保鲜膜覆盖的幻灯片，并在4 ° C至5天。 移液器染色胚胎小降了70％的甘油/ PBS或其他抗淬灭甘油为基础的安装媒体（例如Slowfade或Vectashield）果冻床上用品一侧。 开始预调胚胎单独转让果冻表面下降。他们转移使用一个倾斜的注射针，用勺子倾斜侧壁。 大致的地方沿2〜3列的胚胎。如果一个胚胎获取滞留针，搅拌它包含其他的胚胎来释放它的下降。仔细对准他们在这一点上，不要浪费时间。列之间留一些空间。 将胚胎滑的果冻中等水平皮下注射针头的援助。虽然滑动，东方的头和尾巴在同一方向。使他们彼此平行沿柱。删除与一块扭曲Kimiwipe的足迹留下的PBS甘油的过剩。 注意：过量的甘油会导致胚胎内凝胶松散的包裹，导致两个果冻层的分离，使其难以切割和装入。相反，清除过多的甘油就会枯竭和扁平化的胚胎。 使用切割黄尖遍布一层薄薄的胚胎（50-150μL，对齐多少而定）的果冻。 将幻灯片，在-20 ° C冰箱10-20分钟，或保存在4 ° C过夜。确保果冻是完全刚性的，切割前。否则，胚胎块将很难消费。切割的最好成绩是获得翌日。 根据解剖范围，使用刀片完全对齐的胚胎两侧穿过果冻。保持在90度角直线切割刀片。这次裁员应该是非常接近的胚胎的前部和后部的两极，以避免过量的果冻，可能会阻碍成像。 加入100-200μL冷PBT（4 ° C，PBS +0.1％吐温20）未来的削减，小心地刮去使用抹刀的胚胎之间的果冻。 注：在PBT的洗涤剂帮助果冻取消不损害胚胎的情况下的幻灯片。 用针，转让与嵌入式胚胎进一步削减到一个干净的幻灯片的果冻块。 5-7胚胎切割更小的块。使用PBT轻松地左右移动的果冻块。另外，放置在干燥的玻璃表面块让它附着于玻璃，创造更多的精确修剪果冻，如果有必要的稳定。 翻转直立在果冻的嵌入式刀片和针援助的胚胎。在显微镜下可视化，进行下面的两个步骤中的任一个，视显微镜上的立场正在使用。 倒置显微镜：地方完成到盖玻片的胚胎与胚胎在直立位置，块。确保果冻量最少的胚胎方将加强与客观联系。 立式显微镜：四个＃1盖玻片被用来作为“支持”和地方之间的“支持”，在甘油中的胚胎块用强力胶胶合两个栈。大桥的堆栈使用长盖玻片。 共聚焦分析，检查工作要使用的目标的距离，找出是否可以形象通过胚胎或仅部分。例如，D.果蝇胚胎〜0.55毫米，长度和使用计划一个蔡司20X – APO或40X LD新福陆公司的目标可以完全成像。下面的网站有可用蔡司目标的信息，让您选择搜索目标，根据工作距离：https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2。代表性的成果因为胚胎将保持不变，这种方法可用于精确的测量胚胎的大小和基因表达模式之间的距离。在图1中，我们显示一个核染色的DAPI（蓝色），反背蛋白（红色），SOG的mRNA（黄色）和SNA的mRNA（绿色）染色的胚盘阶段的胚胎。形态议事录SES，如内陷（图2A，B）的中胚层和中胚层细胞（图3和4）迁移也可以可视化使用此方法。不同沿DV轴Z轴位置可通过改变焦平面，如在图2-4所示。 图1。直立式光学切片一个完整的胚胎中胚阶段。mRNA和蛋白的双重染色。图中的靶mRNA 原位探测（SOG和SNA）和抗体染色的蛋白（反手背）表示。 DAPI是用来标记细胞核。注意位于顶部SOG和SNA的表达在细胞质中，而背的表达是核。 SOG新生的成绩单，位于细胞核的强有力的信号，也可以看到在这个放大倍数。 图2。一个完整的胚胎gastrulating直立成像。基因探针和各自的颜色如图所示。一）请注意，在这个阶段，三个基因相同的福陆公司（SNA，SOG和民进党，绿色），染色，表示在空间上分离的的域中。内陷中胚层表示SNA，成神经细胞层表示IND和外胚层表示， 民进党SOG的表达，而在腹侧神经系统的地区仍然存在。 B）在一个更深的共聚焦平面相同的胚胎，我们注意到强烈表示 SNA内陷中胚层的基础，但它的顶端区域表达水平较低。 图3。一个完整的胚胎与生殖带直立成像扩展 SOG RNA（黄色）; 蜗牛，IND和民进党的mRNA（绿色），背蛋白（红色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。一）焦平面胚胎头部附近。 B）另一个在同一胚胎的躯干地区的焦平面。注意群众中胚层细胞的横向迁移前，躺在生殖波段扩展胚胎两侧靠近腹侧中线（比较图4）。分层神经母细胞被标记为绿色（IND和SNA）。 图4。一个完整的胚胎生殖波段扩展期间 SOG RNA（黄色）; 直立成像。 蜗牛，IND和民进党的mRNA（绿色），背蛋白（红色）。 A）注分层神经母细胞从上皮细胞（箭头），染色IND和SNA都在这个阶段（绿色）。还要注意的SOG限制表达的腹侧中线（黄色）。胚胎（星号）的侧面可以看出，民进党在这个阶段中的表达。二）在同一胚胎的光学部分显示在一个胚胎的长度，对应于中后区附近。腹侧中线细胞染色SOG。