암 줄기 세포 (CSCs)이 malignancies의 숫자에서 확인되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 인간의 췌장 선암의 xenografts에서 CSCs을 분리하는 알데히드 탈수소 효소의 활동과 CD44과 CD24 표현을 활용 흐름 cytometric 방법을 설명합니다. 이 가능한 전지는 다음 기능 분석 연구에 사용할 수 있습니다.
암 줄기 세포 (CSCs)이 malignancies의 증가에 확인된하고 기능 자기 갱신을 받아야하고 차별화된 자손 하나를 생산하는 능력에 의해 정의됩니다. 이러한 속성은 immunocompromised 생쥐에 주입했을 때 CSCs 원래 종양 요점을 되풀이 수 있습니다. 상피 강한 악의 이내 CSCs 먼저 유방암에 설명된 및 특정 세포 표면 항원 발현 (CD44 + CD24 낮은 / -) 표시 발견된 2. 이후 CSCs는 CD44과 CD24뿐만 아니라 다른 표면 항원의 번호를 사용하여 다른 사람 malignancies의 증가에서 확인되었습니다. 알데히드 탈수소 효소 (ALDH) 활동을 포함한 Physiologic 속성, 또한 3-5 악성 조직에서 CSCs을 분리하는 데 사용되었습니다.
최근 우리와 다른 ALDH 활동과 세포 표면 항원 CD44와 CD24, CD133과 6-8의 표현에 따라 췌장 선암에서 CSCs을 확인. 이러한 고도로 tumorigenic 인구하거나 수 중복 및 기타 기능이 표시되지 않을 수 있습니다. 우리는 발견 ALDH + 및 CD44 + CD24 + 췌장 CSCs가 비슷하게 tumorigenic하지만, ALDH + 세포가 상대적으로 더 많은 침략 8. 이 프로토콜에서는 낮은 통로 인간 xenografts 9 시부터 가능한 췌장 CSCs을 분리하는 방법을 설명합니다. Xenografted 종양은 생쥐에서 수확 및 단일 세포 현탁액으로 만들어집니다. 조직 파편과 죽은 세포는 살아 세포에서 분리 후 CD44과 CD24에 대한 항체를 사용하고 ALDEFLUOR 시약, ALDH 10 형광 기판을 사용하여 얼룩 있습니다. CSCs 그때 형광 활성 세포 분류에 의해 격리됩니다. 절연 CSCs 그런 다음 가능한 세포를 필요로하는 분석이나 기능 assays 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 인간 xenografts에서 췌장 CSCs의 고립을 설명합니다. 이 절차의 몇 가지 주요 단계는 가능한 CSCs의 수율을 향상시킬 것입니다. 췌장 CSCs의 순수한 인구의 복구 FACSAria에 정렬하기 전에 세포 현탁액에있는 가능한 세포의 순도에 따라 달라집니다. 최대 지름 1 cm 미만 xenografts를 사용 돌보는 것은 종양의 중심부에 괴사 조직의 양을 줄이는 데 도움이됩니다. 또한 Ficoll – Paque 기울기 원심 분리하는 동안 조직 파편과 죽은 세포의 세포 현탁액을 파괴하는 것은 중요하고 세포가 hemocytometer를 계산하는 경우 조직 파편이나 비 가능한 세포의 많은 수의가 감지하는 경우 반복 수 있습니다.
얼룩 프로토콜 여기에 특정 세포 표면 항원을 감지하는 ALDH 활동뿐만 아니라 형광단 – 복합 항체를 감지 ALDEFLUOR 시약 시스템을 활용하여 설명했다. ALDEFLUOR의 얼룩은 37 ° C 수행하고, 따라서 항체 얼룩이 (얼음) 37에서 일어날 수있는 항체가 상한의 가능성, ° C.을 방지하기 전에 완료해야합니다 세포 ALDEFLUOR 시약을 유출 수 있기 때문에 4 ALDEFLUOR 버퍼에있는 세포를 유지하는 것이 중요합니다 ° ALDEFLUOR의 얼룩 후 C가 완료되었습니다. ALDEFLUOR 버퍼는 ALDEFLUOR의 세포내 수준을 유지하는 데 도움이 약물 유출 억제제가 포함되어 있습니다.
이 방법은 가능한 췌장 CSCs를 분리 이후 그들은 이러한 세포의 생리 기능을 측정하는 실험의 숫자 적용할 수 있습니다. 우리는 immunocompromised 쥐 및 체외 세포 마이 그 레이션 / 침공 assays를 이용한 종양 – 개시 assays 이러한 세포를 사용했습니다. 또한, RNA, DNA, 그리고 단백질은 CSC 및 비 – CSC의 인구를 비교 분석 연구에 대해 이러한 세포에서 수집한 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 WM으로 국립 보건원에서 보조금 (CA127574, CA107040 및 CA09071)에서 지원이
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-118 | ||
Fetal calf serum | Harlan (Indianapolis, IN) | BT-9501 | ||
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Collagenase type IV | Invitrogen | 17104-019 | ||
Dispase | Sigma (St. Louis, MO) | D4818 | ||
100 x 20 mm culture dish | BD Biosciences (San Jose, CA) | 353003 | ||
70-μm filter | BD Biosciences | 352350 | ||
50-mL conical tube | BD Biosciences | 352070 | ||
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare (Upsala, Sweden) | 17-1440 | ||
ALDEFLUOR reagent system | Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 01700 | ||
Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | ||
12 x 75 mm polystyrene test tubes | BD Biosciences | 352054 | ||
CD44-APC (clone G44-26) | BD Biosciences | 559942 | ||
CD24-PE (clone ML5) | BD Biosciences | 555428 | ||
Mouse CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | ||
Mouse lineage-biotin | Miltenyi Biotec (Auburn, CA) | 130-092-613 | ||
Mouse H-2Kd-biotin | BD Biosciences | 553564 | ||
IgG2bκ-APC | BD Biosciences | 555745 | ||
IgG2aκ-PE | BD Biosciences | 555574 | ||
Streptavidin-PerCP protein | BD Biosciences | 554064 | ||
Propidium iodide | Sigma | P4170 | ||
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps | BD Biosciences | 352235 |