がん幹細胞(CSC)が悪性腫瘍の数が同定されている。このプロトコルでは、ヒト膵臓腺癌の異種移植片からCSCを分離するアルデヒド脱水素酵素活性とCD44とCD24の発現を利用したフローサイトメトリー法を説明します。これらの生細胞は、機能的分析の研究で使用することができます。
がん幹細胞(CSC)が悪性腫瘍の増加に同定されており、機能的に自己再生を受け、分化した子孫1を生成する能力によって定義されます。これらのプロパティは、免疫不全マウスに注入するとCSCは、元の腫瘍を再現することができます。上皮悪性腫瘍内のCSCは、最初の乳癌で記述し、特定の細胞表面抗原の発現(CD44 + CD24 低/ – )を表示することが見出された2。それ以来、CSCは、CD44とCD24を使用して、他のヒト悪性腫瘍の増加だけでなく、他の表面抗原の数で確認されている。アルデヒド脱水素酵素(ALDH)活性、生理的な特性は、、また悪性組織3月5日からCSCを分離するために使用されています。
最近、我々と他の人はALDH活性と細胞表面抗原CD44とCD24、およびCD133 6-8の発現に基づいて、膵臓腺癌からCSCを同定した。これらの高度に腫瘍発生の集団はまたは重複になると他の機能が表示されない場合があります。我々が発見したALDH +とCD44 + CD24 +膵臓のCSCは、同様に腫瘍形成であるが、ALDH +細胞は、比較的多くの侵襲的な8である。このプロトコルでは、継代数の低い人間の異種移植片9から実行可能な膵臓CSCを分離する方法を説明します。異種移植腫瘍は、マウスから採取し、単一細胞懸濁液に作られています。組織の残骸や死細胞は生細胞から分離し、CD44とCD24に対する抗体を使用し、ALDEFLUOR試薬、ALDH 10の蛍光基質を用いて染色される。 CSCは、蛍光活性化細胞選別によって分離されています。隔離されたCSCはその後、生細胞を必要とする分析的または機能的アッセイに使用することができます。
このプロトコルは、ヒトの異種移植片からの膵臓のCSCの分離を説明します。この手順では、いくつかの重要な手順は、実行可能なCSCがの収量を向上させます。膵臓のCSCの純粋な人口の回復はFACSAriaでの並べ替えの前に細胞懸濁液中に存在する生細胞の純度に依存しています。最大直径1センチ未満の異種移植片を使用するように注意しながら腫瘍の中心部に壊死組織の量を減らすのに役立ちます。さらに、をFicoll – Paque勾配遠心分離時の組織の残骸や死細胞の細胞懸濁液を破壊することは非常に重要ですし、細胞を血球計でカウントされているときに組織の破片や非生存細胞の数が多いが検出された場合に繰り返すことができます。
ここで説明する染色のプロトコルは、特定の細胞表面抗原を検出するためのALDH活性だけでなく、蛍光色素標識抗体を検出するためにALDEFLUOR試薬のシステムを利用しています。 ALDEFLUOR染色は37℃と、それゆえ、37℃で起こることができる、キャッピング抗体の可能性を防ぐために(氷上)抗体染色の前に完了する必要がある℃を実行される細胞がALDEFLUOR試薬を排出できるので、それがALDEFLUORの染色が完了した後4℃でALDEFLUORバッファーで細胞を維持することが重要です。 ALDEFLUORバッファーはALDEFLUORの細胞内レベルを維持できるように薬剤排出抑制剤が含まれています。
このメソッドは実行可能な膵臓CSCを分離するので、それらはこれらの細胞の生理的機能を測定する実験の数に適用することができます。我々は、免疫不全マウスおよびin vitroでの細胞移動/浸潤アッセイを利用した腫瘍イニシエーションアッセイのためにこれらの細胞を使用している。さらに、RNA、DNA、及びタンパク質は、CSCと非CSC集団を比較分析研究のためにこれらの細胞から採取することができる。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、WMに国立衛生研究所からの補助金(CA127574、CA107040とCA09071)によってサポートされていました
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-118 | ||
Fetal calf serum | Harlan (Indianapolis, IN) | BT-9501 | ||
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Collagenase type IV | Invitrogen | 17104-019 | ||
Dispase | Sigma (St. Louis, MO) | D4818 | ||
100 x 20 mm culture dish | BD Biosciences (San Jose, CA) | 353003 | ||
70-μm filter | BD Biosciences | 352350 | ||
50-mL conical tube | BD Biosciences | 352070 | ||
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare (Upsala, Sweden) | 17-1440 | ||
ALDEFLUOR reagent system | Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 01700 | ||
Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | ||
12 x 75 mm polystyrene test tubes | BD Biosciences | 352054 | ||
CD44-APC (clone G44-26) | BD Biosciences | 559942 | ||
CD24-PE (clone ML5) | BD Biosciences | 555428 | ||
Mouse CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | ||
Mouse lineage-biotin | Miltenyi Biotec (Auburn, CA) | 130-092-613 | ||
Mouse H-2Kd-biotin | BD Biosciences | 553564 | ||
IgG2bκ-APC | BD Biosciences | 555745 | ||
IgG2aκ-PE | BD Biosciences | 555574 | ||
Streptavidin-PerCP protein | BD Biosciences | 554064 | ||
Propidium iodide | Sigma | P4170 | ||
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps | BD Biosciences | 352235 |