בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

1. קציר xenografts מעכברים הכן את התא דיסוציאציה חיץ: שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין, סטרפטומיצין, 200 U / mL collagenase סוג ד ', ו 0.6 U / mL dispase. Athymic (נו + / נו +) עכבר מחסה סרטן הלבלב האנושי תת עורית xenograft כי הוא פחות מ 1 ס"מ קוטר הגדול ביותר הוא להרדים בחנק פחמן דו חמצני ו נקע בצוואר הרחם. הגידול תת עורית היא שנקטפו מן האגף של העכבר על ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים ומספריים והניח מיד למאגר תא דיסוציאציה. גידולים שקל והניח בחזרה לגרם 1 של רקמת הגידול לתוך 10 מ"ל תא דיסוציאציה חיץ. 2. צור השעיה תא בודד מתוך xenografts עבודה סטרילית biosafety הממשלה, הגידול מועבר 100 x 20 מ"מ צלחת עם תרבות מ"ל 1 של חיץ ניתוק התא. גידולים טחון מכנית באמצעות סכיני גילוח סטרילית מלקחיים. המתלים תאים סרטניים הוא triturated דרך pipet 5 מ"ל סרולוגיות 10 פעמים. חתיכות הגידול צריך להיות קטן מספיק כדי לא להדביק את pipet 5 מ"ל סרולוגיות. המתלים תאים סרטניים מועבר צינור 50 מ"ל חרוטי המכיל את נפח הנותרים של התא דיסוציאציה חיץ (מלא פחות מ 50%) vortexed במהירות המרבית למשך דקה 1. המתלים תאים סרטניים הוא מודגרות אז מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם vortexing לסירוגין במשך דקה 1 כל 20 דקות ב 37. 3. לכלות השעיה Cell של פסולת רקמות תאים מתים לאחר דגירה 2 שעות השעיה התא vortexed במהירות המרבית למשך דקה 1. ההשעיה התא לאחר מכן עבר דרך פילטר 70 מיקרומטר ואסף בתוך שפופרת 50 מ"ל טרי חרוטי והותאמו נפח סופי של 15 מ"ל לכל צינור. כדי להמשיך תאים קיימא להפריד תאים מתים ופסולת רקמות, תאים סרטניים ההשעיה היא מופרדים על ידי צנטריפוגה צפיפות באמצעות Ficoll-Paque פלוס. Underlayment של Ficoll-Paque Plus נוצר על ידי pipeting 15 מ"ל של Ficoll-Paque פלוס לאט מתחת ההשעיה תא נזהרים שלא לערבב את שתי השכבות. השעיית התא שכבות Ficoll הם הוא centrifuged בשעה 500x גרם במשך 30 דקות עם הבלמים כבוי. תאים על הממשק של Ficoll-Paque פלוס חיץ ניתוק התא נאספים ומועברים שפופרת 50 מ"ל טרי חרוטי. DMEM טריים בתוספת FCS 10% מתווסף ההשעיה תא לדלל אותה 01:03 (למשל 20 מ"ל התקשורת טרי הוסיף 10 מ"ל של השעיה התא). התאים נאספים על ידי צנטריפוגה בשעה 450x גרם במשך 10 דקות, התקשורת יצק, ואת גלולה התא resuspended ב 1 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR. עשרת מיקרוליטר של השעיה התא מדולל עם 10 μL trypan כחול תאים קיימא נספרים באמצעות hemocytometer. אם מספר גדול של תאים מתים או פסולת רקמות מצוינים במהלך שלב זה, אז ההפרדה התא על ידי צנטריפוגה צפיפות ניתן לחזור (שלבים 3.3-3.7). 4. הכתם תאים עבור מיון פלואורסצנטי תא פעיל Seven לייבל 12 x 75 מ"מ פוליסטירן מבחנות כדלקמן: בלא כתם CD44-APC CD24-PE עכבר CD31-ביוטין + עכבר השושלת-ביוטין + עכבר H-2Kd-ביוטין ALDEFLUOR ALDEFLUOR DEAB + + IgG 2bκ-APC + IgG 2aκ-PE ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + עכבר + CD31-ביוטין עכבר השושלת-ביוטין + עכבר H-2Kd-ביוטין. לדלל את ההשעיה תא 2 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR לריכוז סופי של 5-10000000 תאים / מ"ל ​​ולשמור על הקרח. הוספת 100 μL של ההשעיה התא צינורות # 1, 2, 3 ו 4 ולשמור אותם על הקרח. הוסף 1 DEAB μL אל צינור # 6 ולשמור על הקרח. הוסף מגיב ALDEFLUOR על ההשעיה תא הנותרים בדילול 1000 – לקפל (למשל להוסיף 1.6 μL מגיב ALDEFLUOR להשעיית 1.6 תא מ"ל), ומערבבים היטב, ומניחים על קרח. העברת 100 μL של תערובת זו צינורות # 5 ו -6, וכן את התערובת שנותרה (1.4 מ"ל) אל צינור # 7. דגירה של כל הצינורות בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. מערבבים את ההשעיה תא כל 10 דקות כדי למנוע את התאים מן ההתיישבות אל החלק התחתון של הצינורות. צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו – 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי צינורות # 1 ו -5 במאגר 100 ALDEFLUOR μL. כדי # 2 צינורות, 3, 4 ו 6, להוסיף 100 μL של חיץ ALDEFLUOR המכיל את הנוגדנים המתאימים בדילול כדלקמן: 1:20 עבור IgG 2bΚ-APC, IgG 2aΚ-PE, APC-CD44, CD24 ו-PEנוגדנים; 1:100 עבור העכבר CD31-ביוטין, עכבר השושלת, ביוטין, ועכבר H-2Kd-ביוטין נוגדנים. כדי צינור # 7 להוסיף 1.4 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל דילול של 1:20 APC-CD44, CD24 ו-PE נוגדנים דילול 1:100 של העכבר CD31-ביוטין, עכבר השושלת, ביוטין, ועכבר H-2Kd-ביוטין נוגדנים. דגירה השעיות התא על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו – 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי במבחנות מס '1, 2, 3, 5, 6 במאגר 100 ALDEFLUOR μL. הכן 1.5 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל דילול 1:100 חלבון streptavidin-PerCP. הוספת 100 μL אל צינור # 4 ולהוסיף 1.4 מ"ל על צינור # 7. דגירה השעיות התא על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו – 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי במבחנות מס '1, 2, 3, 4, 5, 6 במאגר 200 ALDEFLUOR μL. Resuspend גלולה בצינור # 7 ב 2.8 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​יודיד propidium. שמור צינורות על הקרח בכל עת. מעבר תאים דרך 35 מיקרומטר מסנן באמצעות 12 x 75 מ"מ פוליסטירן מבחנות עם כובעים מסננת. 5. בודד סרטן בתאי גזע על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל Cytometer תזרים FACSAria מוכן מיון התא. שולטת פיצוי נקבעים באמצעות תאים צינורות # 1, 2, 3, 4 ו 5. גייטס נוצרות מבוסס על קדימה ועל תופעות פיזור פרמטרים לאסוף singlets התא. עכבר Non-(PerCP שלילי) ובת קיימא (שאינם propidium מוכתם יודיד) התאים מגודרת באמצעות ערוץ FL-3. ALDH תאים + נאספים על בסיס השערים שנוצרו באמצעות DEAB שטופלו בתאים (צינור # 6) ואת ערוץ FL-1. CD44 + CD24 + תאים נאספים על בסיס השערים שנוצרו באמצעות תאים מוכתם ALDEFLUOR, IgG 2bΚ-APC, ו IgG 2aκ-PE (צינור # 6) באמצעות FL-4 ו FL-2 ערוצים. התאים נאספים 12 x 75 מ"מ פוליסטירן מבחנות המכילות 1 מ"ל של DMEM FCS בתוספת 10%. אחרי תאים מוינו, צנטריפוגה ההשעיה התא 450x גרם במשך 10 דקות, למזוג התקשורת, resuspend התאים 500 DMEM טרי μL בתוספת FCS 10%. ספירת תאים ממוינים באמצעות hemocytometer כמתואר בשלב 3.8. 6. נציג תוצאות פרוטוקול זה יוביל לבידוד של ALDH + ו-CD44 + CD24 + הלבלב CSCs. אחוז התאים בעכבר הנגזרות משתנה, אך מצאנו כי האדם ביותר סרטן הלבלב xenografts מכילים 20-60% בתאי עכבר הנגזרות באמצעות העכבר CD31, קוקטייל עכבר השושלת, ועכבר H-2Kd ביוטין, מצומדות נוגדנים (איור 1A ). כמו כן התדירות של האוכלוסייה בכל CSC מ xenografts שונים משתנה, אבל בדרך כלל מצאנו כי 1-4% מכלל האוכלוסייה תא הכולל הוא ALDH + (איור 1B) ו 0.2-5% הוא CD44 + CD24 + (תרשים 1C). אנו שגרתי ידני לספור תאים ממוינים באמצעות hemocytometer מאז מונה FACSAria מכונה לעיתים קרובות לא מדויקים בגלל אי ​​- סלולרי חלקיקים זוהה על ידי FACSAria. באיור 1. Cytometry העלילה זרימה המתאר אוכלוסיות ספציפיות xenograft בסרטן הלבלב. (א) תאים מכתים חיובי בערוץ-3 FL (propidium יודיד + עכבר + + CD31 עכבר השושלת, או עכבר H-2Kd +) נכללות כדי לבודד רק קיימא ושאינם עכבר נגזר תאים. (ב) פעילות ALDH ב xenograft סרטן הלבלב האנושי נמדד על ידי cytometry זרימה באמצעות ריאגנט ALDEFLUOR בנוכחות והיעדר מעכב ALDH1 diethylamino-benzaldehyde (DEAB). מסגרות מייצגות שערים המתארים תאים + ALDH שנוצרו על בסיס תאים שטופלו DEAB ולאחר מכן להחיל בתאים שלא טופלו. האחוזים של תאים ALDH + מוצגים השער. (ג) CD44 + CD24 + שער נוצרה על בסיס תאים מוכתם ALDEFLUOR, ואת IgG 2bκ-APC (שליטה isotypic עבור CD44-APC) ו IgG 2aκ-PE (שליטה isotypic עבור CD24-PE) נוגדנים. האחוזים של CD44 + CD24 + תאים מוצגים השער.