İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

1. CldU ve IDU Etiketleme Dokular Suda çözülür timidin analogları (CldU veya IDU). Her kimyasal 1 mg / ml tartılır ve distile su cam şişelerde ayrı ekleyin. Biz genellikle bir defada her 1 litre hazırlar. Bir heyecan plakası veya karıştırıcı diğer formu kimyasalların çözülür. CldU 10 dakika içinde eriyecektir. oda sıcaklığında ajitasyon. IDU 37 ajitasyon bir saat ° C ile sallama daha fazlasını gerektirir. Su kaynakları IDU çözünürlüğü etkileyebilir. IDU gecede sallayarak sonra askıya alınmadan devam ederse, daha temiz bir su kaynağı deneyin. Çözümler 4 ° C karanlıkta 'de saklanır. Yönetici istenilen etiketleme dönemi için farelere ilk timidin içeren solüsyonu (ya CldU veya IDU). Fareler etiket döneminde etiketsiz suya erişim için izin vermeyin. Belirlenen etiketleme dönemi tamamlandığında, (timidin içeren analogları birkaç saat serum yarı-ömürleri vardır), en az 24 saat süreyle etiketsiz su ile yıkanmaya başlar. Yönetici istenilen etiketleme dönemi için farelere ikinci timidin içeren solüsyonu (ya CldU veya IDU). Yedek su şişeleri düzenli olarak su kaybını önlemek için! Alternatif olarak, fare CdlU ve sonra IDU sıralı intraperitoneal etiketli olabilir. 10 mg / ml konsantrasyonda CldU veya IDU hazırlayın. IDU süspansiyon içine gitmek için kuvvetli sallayarak takip konsantre sodyum hidroksit çözeltisi damla akıllıca ek gerekebilir. Aşırı sodyum hidroksit ilave etmeyin. Sodyum hidroksit IDU 10 ml çözümü için tek bir damla 37 ajitasyon bir saat takip ° C ile sallama ekleyin. Eğer çözelti içinde değil, sodyum hidroksit ilavesi tekrarlayın. Intraperitoneal uzaya g vücut ağırlığı başına 100 mcg enjekte edilir. Kontrol slaytlar, bu protokol için esastır. Sonuç olarak, biz araştırmacılar duyarlılık ve özgüllük sağlamak için çeşitli varyasyonlar timidin analoğu etiketleme yürütmek şiddetle öneririz. Bu 1 içermelidir. Sadece CldU ile etiketlenmiş Fare, 2. Sadece IDU ile etiketlenmiş Fare, 3. Sırayla CldU ve sonra IDU ile etiketlenmiş edildi Fare, 4. IDU ve sonra CldU sırayla ilk tersten etiketli Fare, sadece su ile etiketli sahte 5 Fareler. CldU ve IDU etiket öğrenme, araştırmacılar her zaman ilgi doku kontrolü slaytlar tüm 5 yukarıdaki setleri ile tüm protokol yapmalıdır. 2. Doku Harvest Fiksasyon ve Slayt Hazırlama Uygun anestezi kullanarak, öldürücü doz aşımı gerçekleştirmek ve sonra fare exsanguination yoluyla kurban. Taze doku çıkarın ve 24 saat için% 4 4 paraformalehyde ° C ile düzeltmek. 01:04 4 formalin tampon ve mağaza ° C gömmek için doku aktarın. Alternatif olarak, öldürücü doz aşımı gerçekleştirmek ve daha sonra vücutta kan temizlenir kadar tuzlu su çözeltisi ile kalp sol ventrikül ile fare serpmek, hemen ardından% 4 paraformaldehid 30-50 cc serpmek. 01:04 Formalin Tampon ilgi ve mağaza dokuların gömmek için 4 ° C'de çıkarın. Doku dehidrasyon ve parafine gömme sonra, 5 mikron doku bölümleri ve ücret Slaytlarınıza yeri kesti. 65 ° C'de 16 saat boyunca (aşağıda antijen alımı adımları ile gerekli) slayt doku yapışmasını sağlamak için slaytlar pişirin. 3. Dehidratasyon, Permeabilization ve Antigen Alma 5 dakika boyunca iki ksilen hamam slaytlara çeker aşırı parafin çıkarın. her biri. 100, 95, 90, 80 70 ve% 50 etanol su ile seyreltilmiş slaytlar çeker doku rehidrate. Slaytlar 3 dakika bekletin. Her konsantrasyon,% 100 ile başlayan ve son daldırma için% 50 doğru gidiyor. 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın. 1x PBS. 5 dakika (taze, her zaman yaptı)% 0.2 Triton-X çözümü slaytlar çeker hücreleri Permeabilize. Mikrodalga doku antijen alımı için slaytlar hazırlayın. Çözüm evaporatif kaybı hesaba slaytlar üstünden 5 cm kapsar, böylece yeterli bir hacim 0.01m pH 6.0 sodyum sitrat tamponu ile bir cam behere slaytlar yerleştirin. Mikrodalga çözüm kaynar kadar slaytlar (3-10 dk tam güçte). Çözümü, yavaş yavaş kaynayan kadar gücü azaltmak (% 10-80) ve ek bir 20 dakika devam edin. Yavaş kaynatın çözüm kalmasını sağlamak için periyodik olarak mikrodalga kontrol edin. Yeri beher tezgah üstüne slaytları içeren ve oda sıcaklığında (yaklaşık 2 saat), yavaşça soğumasını bekleyin. Slaytları bir termometre kullanarak oda sıcaklığında olduğundan emin olun. 40 dakika süreyle 1.5N HCL daldırın kayar. oda sıcaklığında. Yıkama 1X PBS, 5 dakika içinde iki kez slaytlar. Yıkama başına. 4. İlköğretim ve Ortaöğretim Antikorlar Slaytlar tüm protokolü üzerinden çok nemli kalması önemlidir. Kuru doku daha fazla otomatik olacak-Floresan, ortaya çıkan görüntüleri kullanılmaz hale gelebilirler. Bir zamanda, süreci bir slayt ölüyor engellemek için. (Yani, mum) kalem engelleyen bir sıvı ile Circle slaytlar her bölüm. Slaytlar 1x PBS kap içine yerleştirin. Islak kağıt havlu koyarak, nemli bir kuluçka odasının hava geçirmeyen plastik bir kabın alt düz attı. 1x PBS içinde seyreltilmesi% 10 eşek serum engelleme çözüm olun. Tamamen çözümü ile her bir bölümünü karşılamak için çok önemlidir. 1 x 1,5 santimetre doku bölümleri için, çözüm Bölüm başına 50 mikro-litre bir ses çıkışı yeterli. Slaytlar engelleme çözüm ekleyin. 1x PBS slayt çıkarın ve kuru kağıt havluları bir yığın slayt kenarına hafifçe dokunarak aşırı sıvı ortadan kaldırmak. Kuluçka odasında slayt yerleştirin ve her bölüm için 50 mikro-litre% 10 blok çözüm ekleyin. Tüm slaytları oda sıcaklığında 1 saat süreyle yakın konteyner ve inkübe tamamlandığında. IDU tespit birincil antikor seyreltme hazırlayın. 1x PBS içinde% 5 eşek serum 1:250 konsantrasyonda fare anti-BrdU sulandırınız. Slayt engellemek çözüm dokunun ve kuluçka odasına geri yerleştirin. Her bölüm için yukarıdaki primer antikor ve 4 gece inkübe ° C Yüksek darlığı yıkama (CldU fare anti-BrdU antiserumlar bağlama en aza indiren) hazırlayın. Makyaj taze düşük tuz TBST tampon (pH 8.0 36mm Tris, 50mm NaCl, 0.5% arasında 20). Slayt çifti başına 40 ml tampon gerekecektir. Her biri 50 ml konik tüpüne 40 mL tampon ekleyin. Slaytlar eklemeden önce, ön ısıtma çözümü – 37 ° C Bir seferde iki, kuluçka odasının slaytlar kaldırmak back-to-back (doku örnekleri birbirlerinden uzak bakacak şekilde) koyun ve fazla primer antikor dokunun. Düşük tuz TBST ve kapak ile dolu tüpler slaytlar yerleştirin. Tüpler 20 dakika çalkalayın. 37 sıcaklık bakteri kültürü inkübatör sallayarak ° C ve 225 rpm hız. Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına. Eğer istenirse, CldU ve doku antijeni tespiti için bir sonraki birincil antikor çözüm hazırlayın. 1x PBS içinde% 5 eşek serum 1:250 konsantrasyonda sıçan anti-BrdU sulandırınız. Birincil antikor çözüm çalışma konsantrasyonu doku antijeni karşı birincil antiserumlar sulandırınız. Slaytlar fazla 1x PBS dokunun ve kuluçka odasında koyun. Her bölüm için birincil antikor ve 4 gece inkübe ° C Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına. Ikincil antikor çözüm hazırlayın. Cy2 eşek anti-sıçan 1:250 ve Cy5 eşek anti-fare% 5 eşek serum içeren bir 1X PBS çözüm 1:500 sulandırınız. Cy3 ikincil doku antijeni antiserumlar birincil türleri tespit ettiniz. Ayrıca, ikincil antikor çözüm 1:150 DAPI ml / 0.4mg stok solüsyonu sulandırmak. Inkübasyon odasında aşırı 1X PBS kapalı slaytlar ve yer dokunun. Her bölüm için ikincil antikor çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Slaytları taze 1X PBS içinde iki kez yıkayın. 5 dk. Yıkama başına. Slaytların aşırı 1X PBS dokunun ve Altın anti-solmaya montaj medya (dyanine boyalar Vectashield KULLANMAYIN!) Prolong cam kapak yapışır. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için kapak bordroları basın. 4 ° C saklayınız 5. Görüntüleme ve Analiz Resim, yüksek enerjili bir ışık kaynağı, plan-apochromatic hedefleri ve yüksek verimli bir mikroskop kamera (örneğin Hamamatsu Orca ER) ile donatılmış bir floresan mikroskop ile ilgi doku. AMCA (DAPI), Cy2 (CldU) Cy3 (Doku antijen) ve Cy5 (IDU) kanalları görüntüleri yakalayın. Birleştirme tek bir çok katmanlı görüntü dosyası oluşturmak için görüntüleri. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda, DAPI lekeli çekirdeklerin homojen parlak olacaktır. Doku antijen (örneğin insülin), ilgi hücreleri açığa çıkarmalıdır. DAPI veya doku antijeni ile boyanarak kaldırmak kapağı kayma ve ikincil antiserumlar uygulama tekrarlamak gecede 1X PBS zayıf veya tutarsız batırmayın slayt. Cy3 doku antijeni odaklanın. CldU ve kanallar arasında geçiş Cy2 ve Cy5 kanal IDU boyama, kontrol edin. Belirteçleri, aşırı IDU ve CldU co-pozitifliği arasındaki potansiyel çapraz reaktivite açısından bakın. Sadece CldU veya IDU içeren dokular için bakın. CldU veya IDU pozitif çekirdek eksikliği etiketleme veya boyama ile bir teknik soruna işaret ediyor olabilir. Bu durumda, yüksek replikatif doku (örneğin lenf nodu) bakın. Görüntü analiz. DAPI ve doku antijeni içeren katmanlar görüntüleyin. Baskın elinde bir beyaz tahta marker ve non-dominant el bir hücre sayacı kullanarak, her bir çekirdeği, kuru bir silme işaretleyici (aka beyaz tahta işaretleyici) ile karşıt bir işareti ile işaretleyiniz. DAPI pozitif hücrelerin ilgi doku içinde güvenin. Toplam hücre sayımı kaydedin. Işaretlerini kaldırmak için kuru bir silgi kullanın. Görüntü katmanılar içeren DAPI, doku antijeni ve CldU. CldU pozitif hücrelerin ilgi doku içinde güvenin. Record CldU hücre sayımı ama işaretlerini silmek yok. Değişim, doku antijen, CldU ve IDU içeren katmanlar görselleştirmek için görüntüler. Kont CldU IDU çift pozitif hücreler. Kayıt değeri, bütün işaretlerini silmek ve DAPI, doku antijeni ve IDU içeren katmanlar gösterilecek. Ilgi doku içinde IDU pozitif hücrelerin toplam sayısı güvenin. Tutanak IDU hücre sayımı. 6. Temsilcisi Sonuçlar Biz sırayla hemen kurban takibeden iki hafta için bir hafta ve daha sonra IDU CldU ile 6 haftalık dişi fareler etiketli. Pancreata CldU, IDU ve İnsülin (bir doku antijeni) yanı sıra DAPI algılamak için boyandı. Adacıklar düzgün insülin ile boyandı. CldU lekeli çekirdekleri ayrı IDU lekeli çekirdekleri (Şekil 2). Adanın dışında birçok çekirdekleri CldU IDU co-pozitif (Şekil 2, sağ alt, beyaz oklar). CldU ve IDU (Şekil 2, sağ alt, kırmızı ok), tek bir insülin pozitif hücre nükleer boyanma vardı. Fareler. Philadelphia Çocuk Hastanesi IACUC komitesi yönergelere göre fare ile tüm deneyler yapıldı. Philadelphia Çocuk Hastanesi, laboratuar hayvanları tesiste ev sahipliği Taconic (Germantown New York), PMI Beslenme International (Richmond. Indiana) beslenen Fare Diyet 5015 Kadın B6.129 F1 wild-tip farelerden satın alındı. Strateji Etiketleme. IDU (bu şemada kırmızı işaretli) CldU ile ilk hücre bölünmesi olayı (Bu planın yeşil işaretli) ve ikinci bir hücre bölünmesi etiketleme, CldU ve IDU (yeşil / kırmızı) ile birlikte etiketli hücreleri sıralı hücre bölünmesi sonuçları . Farelerde içinde pankreas hücre yenilenmesini timidin etiketleme Temsilcisi sonuçlar. Langerhans Adacık merkezinde bir fare pankreas Immunofluorescent görüntü. Fare hemen kurban öncesi 2 hafta içme suyu için 1 hafta sonra IDU CldU ile doluydu. Pankreas örnek protokolünde açıklandığı gibi işlendi. 40x objektif görüntüler, farklı katmanları için uygun sayım görüntülenir. Birleştirilmiş görüntüler DAPI (beyaz) CldU (yeşil), IDU (kırmızı), İnsülin (sarı) içerir. (Üst, sol) DAPI ve insülin. (Üst, sağ) CldU ve İnsülin. (Alt, sol) IDU ve İnsülin. (Sağ alt) CldU, IDU ve İnsülin. Ölçek çubuğu: 100μm. Şekil 1. Etiketleme stratejisi. IDU (bu şemada kırmızı işaretli) CldU ile ilk hücre bölünmesi olayı (Bu planın yeşil işaretli) ve ikinci bir hücre bölünmesi etiketleme, CldU ve IDU (yeşil / kırmızı) ile birlikte etiketli hücreleri sıralı hücre bölünmesi sonuçları . Şekil 2 farelerde içinde pankreas hücre yenilenmesini timidin etiketleme Temsilcisi sonuçları. Langerhans Adacık merkezinde bir fare pankreas Immunofluorescent görüntü. Fare hemen kurban öncesi 2 hafta içme suyu için 1 hafta sonra IDU CldU ile doluydu. Pankreas örnek protokolünde açıklandığı gibi işlendi. 40x objektif görüntüler, farklı katmanları için uygun sayım görüntülenir. Birleştirilmiş görüntüler DAPI (beyaz) CldU (yeşil), IDU (kırmızı), İnsülin (sarı) içerir. (Üst, sol) DAPI ve insülin. (Üst, sağ) CldU ve İnsülin. (Alt, sol) IDU ve İnsülin. (Sağ alt) CldU, IDU ve İnsülin. Ölçek çubuğu: 100μm.