小学组织两个胸苷类似物的免疫荧光检测（CldU IDU）

1。标签组织与CldU和IDU 胸苷类似物（CldU IDU）溶解于水。权衡毫克/毫升每一种化学品，并添加到单独的蒸馏水玻璃瓶。我们通常准备的时间每1升。 化解不小的轰动板的化学品或其他形式的搅拌器。 CldU会溶解在10分钟。在室温下的躁动。 IDU要求在37小时的搅拌°一个摇床中的C。水源可以影响IDU的溶解度。如果IDU仍然一夜之间晃动后恢复正常运作，请尝试使用清洁的水来源。在4 ° C黑暗环境中存储的解决方案。 管理的第一胸苷包含所需的标签内的老鼠的解决方案（CldU或IDU）。不要让小鼠在访问期间的标签未标注水。当指定的标签内完成，开始一个与未标记的水冲洗至少24小时（胸苷含有类似物有几个小时的血清半衰期）。管理的第二个胸苷包含所需的标签内的老鼠的解决方案（CldU或IDU）。定期注水瓶，以防止脱水！ 此外，小鼠连续腹腔注射的CdlU然后IDU可以标示。准备在10毫克/毫升的浓度CldU或注射毒品。 IDU可能需要明智的下拉除了浓氢氧化钠剧烈摇晃的​​解决方案进入暂停。不添加多余的氢氧化钠。添加氢氧化钠单下降到10 mL的溶液的IDU的一个小时的搅拌，然后在37 °一个摇床中的C。如果不是在溶液中，除了重复的氢氧化钠。每克体重注入腹腔空间100mcg。 这一协议的基本控制幻灯片。因此，我们强烈建议调查人员进行了胸苷模拟标签的几个变化，以确保敏感性和特异性。这些应包括：1。小鼠只有CldU标记; 2。小鼠与IDU只标记; 3。小鼠与CldU然后IDU相继被标记; 4。顺序标记以相反的顺序，先与IDU，然后CldU的小鼠5只，只有水标记模拟。学习与CldU和IDU的标签时，调查人员应始终贯彻整个协议从该组织的利益与上述所有5套控制幻灯片。 2。组织收获，固定，和幻灯片的制备使用适当的麻醉，进行致命的过量，然后通过放血牺牲的鼠标。取出新鲜组织，并与4％paraformalehyde在4 ° C，24小时内修复。转移组织嵌入1:4福尔马林缓冲和储存在4 ° C。 另外，进行致命的过量然后通过鼠标左与盐溶液的心脏心室灌注，直到血液从人体中清除，然后立即用30-50毫升的4％多聚甲醛灌注。在4 ° C删除嵌入的兴趣和1:4福尔马林缓冲存储的组织。 组织脱水和石蜡包埋后，切成5微米的组织切片和地点将收取的幻灯片。烘烤的幻灯片，在65 ° C下16小时，以确保组织粘连，滑（抗原修复以下步骤至关重要）。 3。脱水，通透，和抗原修复沉浸在两个二甲苯浴5分钟的幻灯片中删除多余的石蜡。每个。 补充水分的组织，通过加水稀释浸泡在乙醇幻灯片：100，95，90，80 70和50％。浸泡3分钟的幻灯片。每个浓度，开始与100％和50％的最终浸泡走向。 洗5分钟的幻灯片。在1X PBS。 通透细胞浸泡在0.2％的Triton – X为5分钟（每次新）解决方案的幻灯片。 微波组织抗原修复准备的幻灯片。放入一个玻璃烧杯的幻灯片足够量0.01M pH值6.0柠檬酸钠缓冲区，这样的解决方案涵盖了5厘米以上的幻灯片的顶部蒸发损失。 微波幻灯片，直到溶液沸腾（3-10分钟在满功率）。减少电源，直到解决方案是慢慢沸腾的（10-80％），并继续为一个额外的20分钟。微波定期检查，以确保解决方案仍然在慢熬。 置于烧杯中含有一条长凳上的幻灯片，并允许轻轻地冷却到室温（约2小时）。 确认幻灯片在室温下使用温度计。 在1.5N盐酸中浸泡40分钟的幻灯片。在室温下。 洗两次幻灯片1X PBS，5分钟。每洗。 4。小学及中学抗体重要的是，幻灯片通过整个协议仍然非常湿润。干组织将有更多的汽车荧光，使所产生的图像无法使用。为了防止死亡，在时间的过程一张幻灯片。 圈每个部分阻塞的液体（即蜡）笔在幻灯片上。到1X PBS的容器放置在幻灯片。 放置湿纸巾潮湿的孵化室平放不透气的塑料容器的底部。 1X PBS稀释10％的驴血清拦截的解决方案。重要的是要完全覆盖与解决方案的每个部分。对于组织切片，1 × 1.5厘米，解决方案，每节50微升量就足够了。 封闭液添加的幻灯片。从1X PBS中取出的幻灯片，并消除多余的液体，由上一摞干纸巾轻轻拍打幻灯片边缘。在孵化室中放置幻灯片，并添加50微升10％块​​解决方案的每个部分。当完成所有的幻灯片关闭容器在室温下孵育1小时。 准备第一抗体稀释，以检测IDU。 1:25 1X PBS浓度在5％驴血清稀释的小鼠抗BrdU。从幻灯片塔块的解决方案，并重新放入孵化室。每节添加上述主要抗体，4℃过夜孵育° C。 准备高紧缩洗（最大限度地减少鼠抗BrdU抗血清CldU约束力）。彩妆新鲜低盐TBST缓冲液（三，36MM，50MM氯化钠0.5％Tween – 20的pH值8.0）。您将需要40毫升每对缓冲区的幻灯片。添加40毫升缓冲每次50 mL锥形管。添加幻灯片之前，解决方案预热至37 ° C。 两个时间，从孵化室中删除幻灯片，将它们放置到（使组织样本面对彼此远离），然后点击关闭多余的抗体。充满低盐TBST和覆盖的管放置在幻灯片。搅拌20分钟管。在一个惊天随温度的细菌培养培养箱在37 ° C，并设置到225转的速度。 洗净的幻灯片，在新鲜的1X PBS的2倍。 5分钟。每洗。 准备下一个主要的抗体溶液CldU和组织抗原的检测，如果需要的话。 1:25 1X PBS浓度在5％驴血清稀释的鼠抗BrdU。在工作​​纳入初级抗体溶液浓度稀释对组织抗原的主要抗血清。 点击多余的1X PBS的幻灯片，并将其放置在孵化室。各节及加入一抗孵育4℃过夜° C。 洗净的幻灯片，在新鲜的1X PBS的2倍。 5分钟。每洗。 准备二次抗体溶液。稀CY2驴抗大鼠，以1:25和Cy5驴抗小鼠在1X PBS含有5％驴血清的解决方案1:500。加入Cy3标记辅助检测组织抗原的抗血清的主要物种。同时，淡化了的DAPI 0.4mg / mL到1:150的股票在二级抗体溶液的解决方案。 在孵化室，塔多余的1X PBS关闭幻灯片和地点。加入二级抗体溶液，每节1小时在室温下孵育。 洗净的幻灯片，在新鲜的1X PBS的2倍。 5分钟。每洗。 塔多余的1X PBS幻灯片和延长黄金防褪色安装媒体（不要使用带有dyanine染料Vectashield！）坚持用玻璃盖。按盖玻片消除气泡。保存在4 ° C。 5。成像和分析配备高能量光源，计划复消色差的目标，和高效率的显微镜摄像头（如滨松ORCA二）荧光显微镜图像的利益的组织。 AMCA（DAPI），CY2（CldU），Cy3标记（组织抗原），和Cy5（IDU）渠道捕捉图像。合并图像来创建一个单一的多层图像文件。 如果正确执行，DAPI染色细胞核，将均匀明亮。组织抗原（如胰岛素），揭示细胞的利益。如果用DAPI或组织抗原染色弱或不一致的，沉浸在1X PBS过夜幻灯片，删除盖玻片和重复二次血清中的应用。 重点组织抗原在Cy3标记。检查CldU和IDU染色CY2和Cy5通道，通道之间切换。寻找潜在的交叉反应过度IDU和CldU合作阳性标记，之间。寻找只包含CldU或注射毒品的组织。缺乏CldU或注射毒品阳性细胞核可能表明一个标签或染色的技术问题。在这种情况下，寻找一个高度复制的组织（如淋巴结）。 分析图像。显示层含有的DAPI和组织抗原。白板使用中的主导和在非优势手的细胞计数，每个细胞核标记与干擦除标记（又名白板）的对比标志。的DAPI阳性细胞计数组织内的利益。记录总细胞计数。使用干燥的橡皮擦，以消除痕迹。显示层小号包含的DAPI，组织抗原，以及CldU。 CldU阳性细胞计数组织内的利益。记录CldU细胞计数，但不清除标记。更改显示可视化层包含组织抗原，CldU，IDU。计数CldU IDU双阳性细胞。记录的值，清除所有标志，并显示层包含的DAPI，组织抗原，IDU。总数IDU阳性细胞计数范围内的利益的组织。记录IDU细胞计数。 6。代表性的成果我们按顺序标记，一个星期，然后IDU 6周龄雌性小鼠两个星期，立即牺牲CldU。胰腺染色检测CldU，IDU，胰岛素（组织抗原），以及DAPI。与胰岛素的胰岛均匀染色。 CldU染细胞核IDU染细胞核（图2）不同。胰岛外的许多核CldU IDU合作阳性（图2，右下角，白色箭头）。一个单一的胰岛素阳性细胞为CldU和IDU（图2，右下角，洋红箭头）核染色。 小鼠。根据费城儿童医院的IACUC委员会的指引，所有实验用小鼠。泰康利（Germantown的纽约），在实验动物设施设在费城儿童医院，和美联储鼠标饮食5015 PMI国际营养（Richmond.印第安纳州）均购自女B6.129 F1野生型小鼠。 标签策略。 IDU（红色标记在这项计划）标记的第一个单元格划分与CldU事件（标记在这个计划中的绿色）和第二次细胞分裂，细胞在合作与CldU和IDU（绿色/红色）标记的细胞分工的结果顺序。 胸苷内小鼠的胰腺细胞的新陈代谢标签代表的结果。小鼠胰腺胰岛胰岛中心与免疫荧光图像。鼠标注入CldU为1周，然后立即牺牲前2周在饮水IDU。胰腺样品处理，在协议中所述。 40X的客观物象，不同的层，显示适合用于计数。合并后的图像包含的DAPI（白）CldU（绿色），IDU（红色），胰岛素（黄色）。 （上，左）的DAPI和胰岛素。 （上，中，右）CldU和胰岛素。 （下，左）IDU和胰岛素。 （低，右）CldU，IDU和胰岛素。比例尺：100μm的。 图1标签策略。 IDU（红色标记在这项计划）标记的第一个单元格划分与CldU事件（标记在这个计划中的绿色）和第二次细胞分裂，细胞在合作与CldU和IDU（绿色/红色）标记的细胞分工的结果顺序。 图2。胸苷代表标签内小鼠的胰腺细胞的新陈代谢结果。小鼠胰腺胰岛胰岛中心与免疫荧光图像。鼠标注入CldU为1周，然后立即牺牲前2周在饮水IDU。胰腺样品处理，在协议中所述。 40X的客观物象，不同的层，显示适合用于计数。合并后的图像包含的DAPI（白）CldU（绿色），IDU（红色），胰岛素（黄色）。 （上，左）的DAPI和胰岛素。 （上，中，右）CldU和胰岛素。 （下，左）IDU和胰岛素。 （低，右）CldU，IDU和胰岛素。比例尺：100μm的。