בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.
מתחמי multiprotein (MPCs) לשחק תפקיד מכריע האיתות בתא, מכיוון שרוב החלבונים ניתן למצוא מתחמי תפקודית או רגולטוריות עם חלבונים אחרים (סאלי, Glaeser et al. 2003). לכן, המחקר של חלבונים רשתות אינטראקציה מחייב אפיון מפורט של MPCs כדי להשיג הבנה אינטגרטיבית של תפקוד חלבונים תקנה. לצורך זיהוי וניתוח, MPCs יש להפריד בתנאים המקומיים. בסרטון זה, אנו מתארים את ניתוח MPCs ידי כחול ג'ל אלקטרופורזה יליד polyacrylamide (BN-PAGE). BN-PAGE היא טכניקה המאפשרת הפרדה של MPCs ב קונפורמציה יליד עם רזולוציה גבוהה יותר המוצעים על ידי סינון ג'ל או צפיפות ultracentrifugation סוכרוז, ולכן הוא שימושי כדי לקבוע את גודל MPC, קומפוזיציה, ואת השפע היחסי (Schägger ו פון יגוב 1991) ; (Schägger, קריימר et al 1994).. לפי שיטה זו, חלבונים מופרדים לפי גודל הידרודינמית שלהם ואת הצורה במטריצה polyacrylamide. הנה, אנחנו מדגימים את ניתוח MPCs של lysates הסלולר הכולל, וציין כי דיאליזה lysate היא צעד חיוני כדי להפוך BN-PAGE החלים אלה דגימות ביולוגיות. באמצעות שילוב של PAGE-SDS BN-first ו המימד השני ממד, אנו מראים כי MPCs מופרדים על ידי-BN אפשר לחלק עוד יותר על ידי SDS-PAGE לתוך מרכיבי האישיות שלהם. ויזואליזציה של מרכיבי MPC על הפרדה בג'ל מתבצע על ידי immunoblotting סטנדרטי. כדוגמה לניתוח MPC על ידי-BN, בחרנו 19S אוקריוטים היטב מאופיין, בשנות ה -20, ו proteasomes 26S.
במחקר זה, אנו מתארים את הניתוח של MPCs ידי-BN. גישה 2D משמש MPCs נפרד הראשון תחת תנאים מקומיים, ולאחר מכן להמשיך לסעף אותם רכיבים בודדים שלהם מימד שנייה SDS-PAGE.
דוגמאות מוכנים lysates מן התא. עבור solubilization של MPCs רבים, חומרי ניקוי מתאים נדרש, אשר שומרת על המבנה של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו משתמשים טריטון 0.1% X-100. עם זאת, חומר ניקוי אופטימלי ריכוז מתאים שלה צריך להיקבע באופן אמפירי לכל MPC. במקרה של טריטון X-100, למשל, זה כבר דווח כי ריכוזים נמוכים אבקת לאפשר זיהוי של צורה dimeric של F 1 F 0-ATPase מורכבות (ארנולד, פייפר et al. 1998). גבוהה טריטון X-100 ריכוזים, לעומת זאת, להוביל ניתוק של dimer ועל גידול מקביל של monomeric ה-F 1 F 0-ATPase מורכבים. זו עולה בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו, היינו מראים כי מורכבות multivalent T-cell receptor (TCR) נשמר בעת חילוץ עם ריכוזים נמוכים של Brij 96, ואילו את השימוש של ריכוז גבוה של חומר ניקוי או אחרת בשם התוצאות digitonin ב מיצוי של monomeric TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). דטרגנטים בשימוש נפוץ שניתן לבדוק כוללים digitonin (0.5-1%), טריטון X-100 (0.1-0.5%), Brij 96 (0.1-0.5%), או dodecylmaltoside (0.1-0.5%). ריאגנטים אלה הם חומרי ניקוי nonionic, אשר נוטים להיות הטוב ביותר עבור יציבות MPC. להיות מודעים לכך קשר עם SDS וחומרי ניקוי חזקים אחרים יש להימנע (קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004).
דיאליזה של lysates נדרש כדי להשיג הפרדה MPC בתוך הג'ל-BN (קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. נראה כי התאמה של ריכוז מלח או הסרת זיהומים נמוך משקל מולקולרי הוא קריטי עבור ברזולוציה גבוהה. ראוי לציין כי גם ההכנות הממברנה MPCs, אשר היו immunopurified ו eluted מאוחר יותר מן הנוגדן, מתאימים PAGE-BN (סוואמי, Siegers et al. 2006). בשני המקרים, הדגימות לא צריך להיות dialyzed להפרדה BN-PAGE, אם תמוגה קרום או elution מתבצעת חיץ BN-תמוגה.
עבור הפרדה חלבון על ידי-BN, Coomassie את הצבע הכחול יש צורך, אשר נקשר לחלבונים unspecifically ומכסה אותם עם מטענים שליליים. ובכך, Coomassie כחול מאפשרת ניידות electrophoretic של חלבונים לכיוון הקתודה ב-pH נייטרלי (Schägger ו פון יגוב 1991); (Schägger, קריימר et al 1994).. יתר על כן, Coomassie כחול מונע הצטברות חלבון הג'ל לערום במהלך אלקטרופורזה. עבור PAGE-BN, Coomassie G250 יש להשתמש במקום Coomassie כחול R250 או colloidal בלוז Coomassie.
לפני הפעלת BN-ג'ל, זה הכרחי על מנת להבטיח כי אחוז הג'ל מתאים לגודל הצפוי של MPC של עניין. Precast BN-ג'לים עם מילויים שונים מאגרים מתאימים זמינים מסחרית מן Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-טריס מערכת ג'ל). אבל BN-ג'לים יכול גם להיות מוכנים באמצעות מערבל צבע יחד עם משאבה persistaltic. כדי להבטיח שיפוע תקין, הנוזל צריך לזרום ללא הרף במהלך לשפוך ובועות יש להימנע. אנו ממליצים על הטעינה של דילולים מדגם שונה על הג'ל מפני עומס יתר יכול להוביל משקעים חלבון בתהליך אלקטרופורזה. בנוסף, BN-ג'לים יש לרוץ 4 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים ולשמור MPCs ללא פגע.
לאחר BN-PAGE, ויזואליזציה של MPCs ניתן להשיג על ידי מכתים Coomassie כחול מבריק, כסוף או מכתים immunoblotting. להקות חלבון דמיינו ידי מכתים Coomassie או כסף מתאימים לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה (קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). במקרה של immunoblotting, תנאי ההעברה האופטימלי עבור MPCs העניין צריך להיקבע באופן אמפירי. שים לב Coomassie כחול מועבר גם במהלך סופג של ג'ל-BN. לכן, ג'ל יהיה חסר צבע לאחר העברת מוצלח, ואילו הממברנה יפעילו צבע כחול. יתר על כן, חשוב לציין כי לא כל נוגדן ראשוני, הפועלת לאיתור לאחר SDS-PAGE, הוא ישים immunoblotting על PAGE-BN. זה יכול לקרות כי הנוגדנים אינם מכירים MPC עניין כי epitope שלהם טמון קונפורמציה הילידים של החלבונים. כדי להתגבר על בעיה זו, אפשר לפגל את החלבונים בתוך הג'ל-BN לפני ההעברה על ידי הרתחת ג'ל בקרוב חיץ מדגם SDS 1x.
בדוגמה שלנו, אנו לא הנושא BN-ג'ל ישירות זיהוי של להקות חלבון. במקום זאת, אנו עוד חילקו את BN-PAGE מופרד lysate ידי dimensi secondעל SDS-PAGE. במימד השני SDS ג'ל, חלבונים monomeric נודדים בתוך אלכסוני היפרבולי בשל הג'ל הדרגתי במחצית הראשונה ואת ג'ל ליניארי בממד השני (קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). זה מאפשר זיהוי קל של MPCs, שכן הם נקודתיים מתחת זה אלכסונית היפרבולי. המשנה ברורה של אחד MPC מופרדים בקו אנכי בממד השני SDS-PAGE. רכיבי כי הם המרכיבים של MPCs dinstinct כמה ניתן לזהות על קו אופקי בהתאם לגודל של MPC. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי מספר המקומות חלבון המופיע בשורה אחת אנכי יכול להיות גם חלק מתחמי נפרד להעביר בעמדה זהה PAGE-BN. ההוכחה הסופית שהם נמצאים MPC אותו ניתן להשיג על ידי נוגדן מבוססי assay משמרת ג'ל. ב assay זה, lysate הסלולר הוא מודגרות עם נוגדן כנגד חלבון מיוצג על ידי אחד המקומות המזוהים לפני PAGE-BN. התוצאה היא שינוי של כל MPCs המכילים חלבון זה כלפי מסה מולקולרית גבוהה בממד הראשון. חלבונים אחרים הם גם חלק MPCs אלה יעברו שינוי זה מורכב ספציפיים ולכן הם קל לזהות בממד השני SDS ג'ל.
לא רק בהרכב MPCs ניתן לנתח על ידי-BN, אלא גם את הנחישות של stoichiometry שלהם הוא אפשרי (Schamel ו Reth 2000); (Schamel 2001), (סוואמי, Minguet et al 2007).. לענין זה, assay NAMOS (יליד נוגדן מבוססי assay ניידות במשמרת) יכולה להתבצע. כמו נוגדן מבוססי assay משמרת ג'ל, lysates הסלולר מודגרת עם ספציפי למקטע נוגדנים חד שבטיים. זה מוביל אינדוקציה של immunoshifts electrophoretic ב BN-ג'לים, המאפשרים היקש מן מידת השינוי על stoichiometry של MPCs
ב conlusion, BN-PAGE מתאים לזיהוי MPCs וקביעת הרכב שלהם, הגודל, כמו גם השפע היחסי. בביצוע כמו assay NAMOS, היא מציעה גם את האפשרות לקבוע את stoichiometry של MPC מסוימים. לאור תחולתה הכללית שלה, טכניקה זו היא כלי מאוד שימושי לאפיון של MPCs (דקר, מולר ואח' 1996.); (Wittig ו Schagger 2008); (וגנר, Rehling et al 2009).; (Wittig ו Schägger 2009) .
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים מיכאל Reth, הרמן Schägger, ומרגריטה קמאצ'ו-קארוואחאל תמיכה מדעית. עבודה זו מומנה על ידי FORSYS מן fuer Bundesministerium Bildung ו Forschung (BMBF), על ידי BIOSS מן Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), ו נתמך בחלקו על ידי יוזמת מצוינות של ממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית (GSC-4, Spemann בית הספר למוסמכים ).