Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

** Deze video protocol is gebaseerd op een bijbehorende publicatie 1: Blue Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de identificatie en analyse van multiprotein complexen. Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, en Wolfgang WA Schamel. Wetenschap STKE 2006 (345): pl2, 25 juli 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Klik hier om deze publicatie te zien . 1. De voorbereiding van gedialyseerd cellysaat Oogst 10×10 6 cellen en pellet door centrifugeren bij 350g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Was de celpellet drie keer met 1 ml ijskoud PBS (recept 1), centrifuge als in stap 1.1. Resuspendeer pellet in 250 ui van de ijskoude BN-Lysis Buffer (recept 2) en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Centrifugeer bij 13.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C om onoplosbaar materiaal te verwijderen. Smelt een gat in de dop van een 1.5-mL microcentrifugebuis het gebruik van de verwarmde grote diameter kant van een Pasteur pipet, en plaats de buis op ijs afkoelen tot 4 ° C. Transfer supernatans van stap 1.4 in de gekoelde buis met het gat in de dop. Plaats een dialysemembraan (moleculair gewicht cut-off van 10 kD) met een pincet op de top van de geopende tube, sluit de dop, en snijd het overtollige dialyse membraan dat uitsteekt. Verzegeling van de dop op de zijkant voorzichtig met Parafilm. Omkeren van de buizen en centrifuge zijn kop tegen de laagst mogelijke snelheid in een 50-mL conische buizen in een celkweek centrifuge voor 10 sec bij 4 ° C. Verwijder de omgekeerde buis uit de centrifuge met een pincet om te voorkomen dat het draaien van de buis goede kant naar boven. Bereid een bekerglas van 100 ml met koud BN-dialysebuffer (recept 3) en een roer plaat. Gebruik minimaal 10 ml van de BN-dialysebuffer per 100-pi monster. Het aanbrengen van de buis met tape op zijn kop in de beker, en verwijder de luchtbellen uit het gat onder de kap met behulp van een gebogen Pasteur pipet. Plaats beker op de top van een magneet roerder, zet de roerder en laat het gedurende 6 uur of een nacht in de koude kamer. Controleer af en toe roeren ervoor te zorgen dat niet is luchtbellen te creëren bij de dialyse membraan. Verzamel de gedialyseerd cellysaat in een nieuwe gekoelde microcentrifugebuis. 2. Storten van BN-gels Gradiënt gel gieten gebeurt bij kamertemperatuur met een gradiënt mixer. Handschoenen moeten worden gedragen, omdat polyacrylamide is zeer neurotoxisch. Vermijd elk contact met de SDS. Plaats de gradiënt mixer op een roer plaat en bevestig deze aan een stuk flexibele slang. Sluit het kanaal met de klep en sluit de slang met een klem. Plaats een magneetroerder 15% in de "high" cilinder aangesloten op de slang. Schroef de flexibele slang in een peristalitic pomp en bevestig een injectienaald tot het einde. Plaats vervolgens de naald tussen de twee glasplaten van de gel apparaat. Bereid 4% (recept 5) en 15% (recept 6) het scheiden van gel-oplossingen, het toevoegen van APS en TEMED onmiddellijk voor gebruik. De gecombineerde volumes moet gelijk zijn aan het volume van de scheidende gel. Giet deze gel-oplossingen in de overeenkomstige cilinders van het verloop mixer (4% in de "low" en 15% in de "hoge" cilinder). Open de afsluiter en de kracht uit de luchtbel in het kanaal tussen de twee reservoirs gel door te drukken op de linker cilinder met uw duim. Schakelaar op de magneetroerder, verwijder de klem en zet de peristalitic pomp tot 5 ml per minuut. Laat de gel langzaam stromen tussen de glasplaten. Zorg ervoor dat de naald altijd boven de vloeistof. Laat alle vloeistof om de gel apparaat in te voeren, en dan zachtjes overlay met isopropanol. Laat de gel polymeriseren voor ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Reinig het apparaat gieten direct met dH 2 O (geen wasmiddel). Verwijder de isopropanol, wassen met dH 2 O, en verwijder de dH 2 O met een Whatman papier. Bereid een 3,2% stacking gel (recept 7), het toevoegen van APS en TEMED onmiddellijk voor gebruik. Giet het stapelen gel op de top van de scheidende gel en de invoering van de kam tussen de glazen platen, het vermijden van bubbels. Nadat de stacking gel heeft gepolymeriseerd Koel de gel tot 4 ° C. Onmiddellijk voorafgaand aan het laden monster, verwijder dan eerst langzaam de kam, te trekken uit op een hoek met het vlak van de gel. Hierdoor kan de lucht om in de zakken snel, waardoor de kwaliteit van de putten verbetert. 3. Scheiding van gedialyseerd cellysaat door BN-PAGE Laad 1 tot 40 ul van gedialyseerd lysaat en 10 tot 20 pl van Marker Mix (recept 10) in de droge putten bij 4 ° C. Overlay van de monsters in elk putje met koude kathode Buffer (recept 8). Vul de binnenste kamer met koud CatHode Buffer en de buitenste / Tweede Kamer met koud Anode Buffer (recept 9). Breng 100 V om een ​​MiniGel of 150V op een grote gel, totdat de monsters zijn binnengekomen de scheidende gel. Laat de gel bij 4 ° C. Verhoog de spanning tot 180 V (MiniGel) of 400 V (grote gel) en lopen tot de kleurstof front bereikt het einde van de gel. De aanloop duurt 3 tot 4 uur voor een mini-, en 18 tot 24 uur voor een grote gel. 4. Tweede dimensie SDS-PAGE Bereid een standaard 10% SDS-gel (recepten 12-15) met een grote baan voor de eerste dimensie BN-PAGE baan, een vaste baan voor het molecuulgewicht marker, en een vaste baan voor een hoeveelheid van de gedialyseerd lysaat dat heeft gemengd met SDS sample buffer (recept 11) en gekookt gedurende 5 minuten op 95 ° C. Gebruik afstandhouders waarvan de dikte werd verhoogd met twee lagen plakband het laden van de BN-PAGE gel slice op de SDS-gel te vereenvoudigen. Verwijder de BN-PAGE-gel in de platen van de elektroforese apparatuur en voorzichtig los te wrikken van een plaat. Verwijder de stacking gel en knip de baan van de BN-PAGE-gel met de eiwitten van belang. Plaats de BN-PAGE gel slice in 2x SDS Sample Buffer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Kook de BN-PAGE gel slice kort (niet meer dan 20 sec) in een magnetron. Incubeer de BN-PAGE gel slice in de hete SDS sample buffer voor nog 15 min bij kamertemperatuur. Laad de BN-PAGE gel slice in de grote meer dan het stapelen gel van de SDS-PAGE gel te vermijden luchtbellen, en overlay het segment met SDS sample buffer. Belasting marker en lysaat controle. Voer de elektroforese volgens standaard protocollen. 5. Detectie van MPC subeenheden door immunoblotting Voor de overdracht voor te bereiden zes Whatman papier en een PVDF-membraan past bij de grootte van de SDS-gel. Incubeer de PVDF-membraan in 100% methanol gedurende 30 s en geniet van de Whatman papieren in transfer buffer (recept 16). Plaats drie Whatman papier, het PVDF membraan, de SDS-gel (te verwijderen stapelen gel), en weer drie Whatman papieren in een sandwich-achtige structuur in een halfdroge overdracht cel. Solliciteer 20 V voor 25 minuten. Detect eiwitten volgens standaard immunoblotting protocollen. 6. Representatieve resultaten Presenteren we de analyse van de eukaryote 19S, 20S en 26S proteasomen als een voorbeeld voor MPC karakterisering door 2D BN / SDS-PAGE (figuur 1A). HEK293 cellen werden gelyseerd met een buffer die 0,1% Triton X-100 als een reinigingsmiddel voor de membranen verstoren en solubiliseren membraaneiwit complexen. Deze lysaten werden gedialyseerd tegen BN-Dialyse buffer om de zouten en kleine metabolieten te verwijderen. Daarna werden mediterrane partnerlanden van elkaar gescheiden door 4-15% gradiënt BN-PAGE, gevolgd door een tweede dimensie SDS-PAGE. Eiwitten werden gevisualiseerd door immunoblotting met antilichamen tegen de subeenheden β2 en Mcp21 van het 20S proteasoom. Figuur 1. Een twee-dimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE benadering met behulp van cellulaire lysaten. (A) Stroomdiagram van een 2D-BN-PAGE/SDS-PAGE aanpak van mobiele lysaten. (B) Schematische schema van een 2D-BN-PAGE/SDS-PAGE. Eiwitten en mediterrane partnerlanden worden van elkaar gescheiden onder natieve omstandigheden door BN-PAGE in een eerste dimensie. Voor de tweede dimensie, eiwitten en / of de mediterrane partnerlanden worden gedenatureerd door middel van SDS in de gel strip na de scheiding door BN-PAGE en vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE. Monomere proteïnen zal migreren in een hyperbolische diagonale als gevolg van de gradiënt gel in de eerste en een lineaire gel in de tweede dimensie. Componenten van een concrete MPC zal worden gevonden onder de diagonaal, gelegen op een verticale lijn. Het is aangetoond dat door een combinatie van eerste dimensie BN-en de tweede dimensie SDS-PAGE, monomere proteïnen binnen een hyperbolische diagonaal door de gradiënt gel migreren in de eerste en de lineaire gel in de tweede dimensie ((Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004);. figuur 1B). Componenten van mediterrane partnerlanden bevinden zich onder deze diagonaal. Eiwitten die subeenheden van dezelfde MPC vertegenwoordigen kan worden gevonden in een verticale lijn in de tweede dimensie, terwijl verschillende plekken van hetzelfde eiwit in een horizontale lijn wijzen op de aanwezigheid van het eiwit in een aantal verschillende Mediterrane partnerlanden. Figuur 2 laat zien dat in ons experiment immunoblotting tegen β2 en Mcp21 bleek de aanwezigheid van specifieke eiwit-complexen die deze proteasomale subeenheden. Beide eiwitten werden gedetecteerd als afzonderlijke plekken gerangschikt in een horizontale lijn, wat aangeeft dat β2 en Mcp21 bestanddelen van verscheidene afzonderlijke mediterrane partnerlanden te vertegenwoordigen. Deze mediterrane partnerlanden kon duidelijk worden geïdentificeerd als de 26S-proteasoom (20S 19S plus kap), de 20S proteasoom, samen met de regelgevende subeenheid PA28, en de 20S proteasomen alleen, op basis van hun omvang en samenstelling. Tezamen bieden deze automaLTS aan te tonen dat endogene mediterrane partnerlanden kunnen worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd door een twee-dimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE benadering met behulp van cellulaire lysaat. Deze methode is toepasbaar voor de bepaling van de omvang, samenstelling, en relatieve rijkdom van de mediterrane partnerlanden. Figuur 2. Opsporen van verschillende vormen van de eukaryote proteasoom door immunoblotting na twee-dimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE. Voor identificatie en analyse van eukaryotische proteasomen, werden HEK293 cellen gelyseerd met 0,1% Triton X-100. Cellulaire lysaten werden gedialyseerd en vervolgens onderworpen aan BN-PAGE (4-15%) te scheiden Mediterrane partnerlanden. Daarna werd een tweede dimensie SDS-PAGE (10%) lopen voor grootte scheiding van individuele subcomponenten. Immunoblotting werd uitgevoerd met specifieke antilichamen herkennen de Mcp21 en β2 subunit van de 20S kern complex, en de regelgevende subeenheid PA28. I. Tabel van specifieke reagentia (alfabetische volgorde): Reagens Vennootschap Reacties 6-aminohexanoic zuur (Ε-aminocapronzuur) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland Deze chemische stof is een irriterend en moeten worden behandeld met handschoenen. Acrylamide-bisacrylamide-oplossing (40%), Mix 32:1 Applichem, Darmstadt, Duitsland Deze oplossing is neurotoxisch en moeten worden behandeld met handschoenen. Bis-tris Roth, Karlsruhe, Germa-ny Brij 96 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland Coomassie blauw G250 Serva, Heidelberg, Duitsland-veel- Niet vervangen door andere vormen van Coomassie kleurstof, zoals Coomassie blauw R250 of colloïdale Coo-Massie blues. Digitonine Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland Digitonine is giftig. Handschoenen worden gedragen bij het werken met buffers of monsters die deze zeep. Dodecylmaltoside Applichem, Darmstadt, Duitsland Triton X-100 Roth, Karlsruhe, Germa-ny Triton X-100 is giftig. Handschoenen worden gedragen bij het werken met buffers of monsters die deze wasmiddel. II. Tabel van specifieke materiaal en apparatuur: Uitrusting Vennootschap Dialysemembranen (moleculair gewicht cut-off 10 tot 50 kD) Roth, Karlsruhe, Duitsland Gelelektroforese systeem Bijvoorbeeld van Bio-Rad, München, Duitsland Gradient mixer Self-made of commercieel verkrijgbaar bij Bio-Rad, München, Duitsland Slangenpomp Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Duitsland Polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Duitsland Semi-droge overdracht apparatuur Bijvoorbeeld van Bio-Rad, München, Duitsland Silicium buis (3 tot 5 mm diameter, 1 m lengte) NeoLab, Heidelberg, Duitsland III. Tabel van de recepten: Nee. Buffers en oplossingen Inhoud Reacties 1 Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) Na 2 HPO 4 8.1 mMKH 2 PO 4 1.5 mM NaCl 138 mM KCl 2,7 mM Oplossing moet pH 7,4 zijn, als goed voorbereid. 2 BN-Lysis Buffer Base buffer Bis-tris 20 mM ε-aminocapronzuur 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8.0 2 mM Glycerol 10% Breng de pH op 7,0 met HCl. Bewaren bij 4 ° C. Wasmiddel Digitonine 0,5 tot 1,0% of Brij 96 0,1 tot 0,5% of Triton X-100 0,1 tot 0,5% of Dodecylmaltoside 0,1 tot 0,5% Protease en fosfatase-remmers Aprotinine 10 ug / mL Leupeptin 10 ug / mL PMSF 1 mM Natriumfluoride 0,5 mM Natrium orthovanadate 0,5 mM De juiste reinigingsmiddel dient empirisch te worden vastgesteld en moet hetzelfde zijn als die in de andere lysisbuffer recepten. Digitonine moet worden toegevoegd vlak voor het gebruik van een 2%-oplossing in voorraad dH 2 O (op te slaan in 5-ml fracties bij -20 ° C). Protease en fosfatase remmen-ORS moeten worden toegevoegd onmiddellijk voor gebruik. Na toevoeging van natrium orthova-nadate, zal de buffer wordt geelachtig van kleur. 3 BN-dialysebuffer Base buffer Bis-tris 20 mM ε-aminocapronzuur 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8.0 2 mM Glycerol 10% Breng de pH op 7,0 met HCl. Bewaren bij 4 ° C. Wasmiddel Digitonine 0,3 tot 0,5% of Triton X-100 0.1% of Brij 96 0,1% of Dodecylmaltoside 0,1% Protease en fosfatase-remmers PMSF 1 mM Natrium orthovanadate 0,5 mM De juiste reinigingsmiddel dient empirisch te worden vastgesteld en moet hetzelfde zijn als die in de andere lysis buffers, maar op de aangegeven lagere concentraties. Reinigingsmiddel moet worden toegevoegd aan pre-vent aggregatie bij het stapelen stap van gelelektroforese. Protease en fosfatase remmen-ORS moeten worden toegevoegd onmiddellijk voor gebruik. 4 3x BN-Gel Buffer Bis-tris 150 mM ε-aminocapronzuur 200 mM Breng de pH op 7,0 met HCl. Bewaren bij 4 ° C. 5 4% scheiden Gel 3x BN-Gel Buffer (recept 4) 5,00 ml Acrylamide / Bisacrylamide 1,50 mL dH 2 O 8,50 mL APS, 10% in dH 2 O 54 uL TEMED 5,4 pi Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie. Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten. 6 15% Scheiden Gel 3x BN-Gel Buffer (recept 4) 5,00 ml Acrylamide / Bisacrylamide 5,63 mL Glycerol 70% 4,38 mL APS, 10% in dH 2 O 42 uL TEMED 4,2 pi Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie. Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten. De concentratie van acrylamide-bisacrylamide kan ook worden gevarieerd als nodig van 10 à 18%. 7 3,2% Stapelen Gel 3x BN-gel Buffer (recept 4) 3,00 ml Acrylamide / Bisacrylamide 0,72 mL dH 2 O 5,28 mL APS, 10% in dH 2 O 120 uL TEMED 12 pi Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie. Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten. 8 Kathode Buffer Bis-tris 15 mM Tricine 50 mM Coomassie blue G250 0,02% Bereid 1 liter als een 10x voorraad, breng de pH op 7,0 met HCl, en bewaar bij 4 ° C. Verdunnen 1:10 met dH 2 O voor gebruik. Niet vervangen door andere vormen van Coomassie kleurstof, zoals Coomassie blauw R250 of colloïdale Coomassie blues. 9 Anode Buffer Bis-tris 50 mM Bereid 1 liter als een 10x voorraad, breng de pH op 7,0 met HCl, en bewaar bij 4 ° C. Verdunnen 1:10 met dH 2 O voor gebruik. 10 Marker Mix Aldolase (158 kD) 10 mg / ml Catalase (232 kD) 10 mg / ml Ferritine (440 en 880 kD) 10 mg / ml Thyreoglobuline (670 kD) 10 mg / ml BSA (66 en 132 kD) 10 mg / ml Bis-tris 20 mM NaCl 20 mM Glycerol 10% Breng de pH op 7,0 met HCl. Bewaren bij 4 ° C. Moleculair gewicht markers zijn ook commercieel verkrijgbaar uit verschillende bronnen, waaronder vitro-gen of Pharmacia. 11 SDS sample buffer Tris 12,5 mM SDS 4% Glycerol 20% Broomfenolblauw 0,02% Pas de pH op 6,8. Ter beperking van disulfidebindingen, voeg 9 ml β-mercapto-ethanol. SDS als een poeder en β-mer-captoethanol zijn giftig. Gebruik daarom handschoenen en werken onder een kap. 12 4x lagere buffer Tris 1,5 M SDS 0,4% Pas de pH op 8,8. SDS als een poeder is giftig. Gebruik daarom handschoenen en werken onder een kap. 13 4x bovenste buffer Tris 0,5 M SDS 0,4% Pas de pH op 6,8. SDS als een poeder is giftig. Gebruik daarom handschoenen en werken onder een kap. 14 10% Scheiden Gel Acrylamide (30%) 2,0 ml 4x lagere buffer 1,5 ml dH 2 O 2,454 mL APS, 10% in dH 2 O 40 uL TEMED 6 pi Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie. Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten. 15 4,8% Stapelen Gel Acylamide (30%) 320 pi 4x bovenste buffer 500 pL dH 2 O 1,16 mL APS, 10% in dH 2 O 20 uL TEMED 2 pl Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie. Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten. 16 Halfdroge Transfer Buffer Tris 48 mM Glycine 39 mM Methanol 20% SDS 0,1% Stel het volume op 1 liter met dH 2 O. Bewaren bij kamertemperatuur. SDS als een poeder en methanol zijn giftig. Gebruik daarom handschoenen en werken onder een kap.