蓝原生聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN - PAGE）分析，从细胞裂解液多蛋白复合物

**本视频协议是基于相关出版物1：蓝色的原生聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN – PAGE）多蛋白复合物的鉴定和分析。 Mahima斯瓦米，加布里埃尔M. Siegers，苏珊娜Minguet，贝恩德Wollscheid，和沃尔夫冈西澳Schamel。 STKE 2006年“科学”（345）：PL2，7月25日，2006年，[作者：10.1126/stke.3892006pl4] 请点击这里查看本出版物 。 1。透析细胞裂解液的制备 10 × 10 6细胞的收获和沉淀，离心350克5分钟，4 ° C 。 1 mL冰冷的PBS（配方1）液洗细胞沉淀三次，离心分离，在步骤1.1。 悬浮颗粒和250μL冰冷的BN -裂解液（配方2）在冰上孵育15分钟。 13,000克离心15分钟4 ° C，移除不溶物。 融化在第1.5 ml离心管使用巴斯德吸管加热大口径方孔，然后置于冰上管降温至4 ° C 步骤1.4转移到冷冻管与孔在第上清。 放置一个与开管的顶部，接近上限钳透析膜（分子量10 kD的切断），并切断多余的透析膜伸出。 一边仔细地用封口膜密封帽。 反转管和离心机上下颠倒，持续10秒的最低速度，在50 mL锥形管在细胞培养离心机可能在4 ° C。卸下离心机使用镊子，以避免转向管右侧的倒管。 准备一个100 mL烧杯中，用冷水BN透析液（配方3）和搅拌板。使用至少10毫升的BN透析每100μL样品缓冲。 贴上管倒在烧杯内的磁带，使用弯曲的巴斯德吸管帽下方气泡从孔中删除。 放在一块磁铁搅拌器顶部的烧杯中，开关上的搅拌器和放置6小时，或在寒冷的房间里过夜。偶尔检查，以确保搅拌创建气泡在透析膜。 收集在一个新的冷冻离心管透析的细胞裂解液。 2。浇注国民凝胶梯度凝胶浇注是在室温下进行的梯度混合器。因为聚丙烯酰胺是高度的神经毒性，必须戴手套。避免接触任何与SDS。 广场上的轰动板梯度混合器，将它附加到了一块软管。使用的阀门关闭通道，并密切与管钳。到“高”缸油管相连，放置一个磁力搅拌器15％。 主题成peristalitic泵软管，并附加一个注射器针头结束。然后，将针凝胶仪器的两个玻璃板之间。 准备4％（配方5）和15％（配方6）分离胶解决方案，加入APS和TEMED前立即使用。合并后的卷应该是平等的分离胶量。 倒入梯度混合器相应的气瓶（4％到“低”到“高”缸和15％），这些凝胶的解决方案。 阀打开了通道连接在左缸用拇指按两个凝胶水库内的气泡和力量。 磁力搅拌器上的开关，取出钳，peristalitic泵切换到5毫升每分钟。允许凝胶玻璃板之间缓缓流。确保针以上的液体总是。 允许所有的液体进入凝胶的仪器，然后轻轻覆盖用异丙醇。允许凝胶聚合至少30分钟在室温。 清洁浇筑设备立即与卫生署2 O（不使用清洁剂）。 删除的异丙醇，洗净与卫生署2，删除用Whatman纸DH 2 O。 准备了3.2％浓缩胶（配方），加入APS和TEMED前立即使用。 倒入浓缩胶和分离胶上介绍玻璃板之间的梳子，避免气泡。浓缩胶聚合后，凝胶降温至4 ° C。 样品装载前，立即取出梳子慢慢地，拉出来凝胶平面的角度。这使得空气进入的口袋迅速，从而提高了井的质量。 3。 BN – PAGE分离细胞裂解液透析 1至40μL透析裂解液和10至20μL标记组合（配方10）负载在干井4 ° C。冷阴极的缓冲液（配方8），覆盖在每口井的样本。 内腔填充冷猫HODE缓冲区，并用冷阳极缓冲外/下腔（配方）。 应用100伏到minigel或150V一个大的凝胶，直到样品进入分离胶。运行凝胶在4 ° C。 增加电压至180 V（minigel）或400V（大胶）和运行，直到染料前沿到达凝胶年底。运行需要3至4小时，为迷你，和18至24小时为一个大的凝胶。 4。第二维的SDS – PAGE BN – PAGE的第一个维度里，一个定期为分子量标记线，并已透析裂解等分一个经常弄一个单一的大巷准备一个标准的10％SDS凝胶（食谱12-15） SDS样品缓冲液（配方11）混合，煮沸5分钟，在95 ° C使用垫片的厚度增加是由两层透明胶带，以简化的SDS凝胶上装载的BN – PAGE凝胶片。 删除的BN – PAGE凝胶电泳仪板，轻轻地撬起来一个板块。 取出浓缩胶和切出车道的BN – PAGE凝胶含有的蛋白质利益。 将2X SDS样品缓冲液孵育的BN – PAGE凝胶片在室温为10分钟。 煮的BN – PAGE凝胶片在微波炉中简要（不超过20秒）。 再在室温下15分钟热SDS样品缓冲液中孵育的BN – PAGE凝胶片。 负载的BN – PAGE凝胶片在大井，在浓缩胶的SDS – PAGE凝胶避免气泡，并覆盖SDS样品缓冲液中分得一杯羹。负载标记和裂解控制。 根据标准协议执行电泳。 5。 MPC的亚基免疫印迹检测转让，准备六的Whatman论文和PVDF膜装修SDS凝胶的大小。 在30秒的100％甲醇孵育PVDF膜和转移的缓冲液（配方16）中浸泡的Whatman论文。 将三个文件的Whatman，聚偏氟乙烯膜，SDS凝胶（删除浓缩胶），并再而三的Whatman在成半干转移细胞的结构类似于三明治的论文。 适用于20 V 25分钟。 检测蛋白质按标准免疫协议。 6。代表性的成果我们目前的货币政策委员会表征真核生物19S，20S和26S蛋白酶体作为一个例子分析2D BN / SDS – PAGE电泳（图1A）。 HEK293细胞裂解用缓冲液含0.1％的Triton X – 100的洗涤剂破坏的膜和溶解膜蛋白复合物。这些细胞裂解液对BN透析缓冲液透析去除盐和小代谢产物。然后由第二维的SDS – PAGE梯度4-15％的BN – PAGE分离，储值卡。蛋白与抗β2亚基和20S蛋白酶体Mcp21抗体免疫印迹可视化。 图1。一个两维BN-PAGE/SDS-PAGE的方法，用细胞裂解液（一）从细胞裂解液的2D BN-PAGE/SDS-PAGE方法的流程图。 （二）一个二维BN-PAGE/SDS-PAGE结构的计划。天然条件下在第一维BN – PAGE分离蛋白质和储值卡。对于第二个层面，蛋白质和/或储值卡，经SDS变性凝胶地带的BN – PAGE分离后，随后的SDS – PAGE。单体的蛋白质会在双曲对角线由于在第一梯度凝胶电泳和第二维线性凝胶迁移。一个具体的货币政策委员会的组件将被发现的对角线，低于位于一条垂直线。 它已被证明，第一维BN和第二维的SDS – PAGE的组合，在双曲对角线由于梯度凝胶的单体蛋白质在第一和第二个维度（线性凝胶迁移（卡马乔瓦哈尔， Wollscheid等等2004）;图1B）。多用途储值卡的组件都位于低于此对角线。代表相同的货币政策委员会亚基的蛋白质，可以发现一个在第二个维度垂直线，而相同的蛋白质在一个水平线上的几个点表明，在几个不同的储值卡中的蛋白质的存在。图2显示，在我们的实验β2和Mcp21免疫印迹显示特定的蛋白质复合物含有这些蛋白酶体亚基的存在。这两种蛋白质检测安排在一个水平线上的个别景点，这表明，β2和Mcp21代表选民的几个不同的储值卡。这些储值卡可以清楚确定的26S蛋白酶体（20S加19S第），20S蛋白酶体调节亚基PA28一起，20S蛋白酶体单独的规模和组成的基础上，。两者合计，这些热塑LTS表明，内源性的多用途储值卡可以由一个二维BN-PAGE/SDS-PAGE使用细胞裂解液的方法识别和特点。此方法适用于多用途储值卡的大小，组成和相对丰度的决心。 图2。免疫后两维BN-PAGE/SDS-PAGE真核蛋白酶体识别和分析真核蛋白酶。不同形式的检测，0.1％的Triton X – 100的HEK293细胞裂解。细胞裂解液，透析，随后遭受的BN – PAGE（4-15％），单独的储值卡。第二维的SDS – PAGE（10％）之后，运行规模的个别子的分离。免疫是承认Mcp21和β2亚基20S核心复杂和调节亚基PA28的特异性抗体。 一表的特定试剂（按字母顺序排列）： 试剂 公司 评论 6 – 氨基己酸 （ε-氨基己酸） Sigma – Aldrich公司，德国Taufkirchen的， 这种化学物质是一种刺激性，应带手套处理。 丙烯酰胺，双丙烯酰胺溶液（40％），混合32:1 Applichem，德国达姆施塔特这个解决方案是神经毒性，应带手套处理。 双三罗斯，卡尔斯鲁厄，Germa – NY Brij 96 Sigma – Aldrich公司，德国Taufkirchen的， 考马斯亮蓝G250 赛瓦，海德堡，德国不要代替其他类型的考马斯如考马斯亮蓝R250或胶体COO – Massie的蓝色染料。 毛地黄皂苷 Sigma – Aldrich公司，德国Taufkirchen的， 毛地黄皂苷是有毒的。处理缓冲区或样品含有这种威慑的绅士时，必须戴上手套。 Dodecylmaltoside Applichem，德国达姆施塔特 TRITON X – 100 罗斯，卡尔斯鲁厄，Germa – NY TRITON X – 100是有毒的。处理缓冲区或样品含有这种洗涤剂时，必须戴上手套。 二。具体的材料和设备表： 设备 公司 透析膜（截止10日至50 kD的分子量） 罗斯，卡尔斯鲁厄，德国凝胶电泳系统例如，来自Bio – Rad，德国慕尼黑梯度混合器自制或商用Bio – Rad公司，德国慕尼黑蠕动泵 Amersham公司Pharmacia公司生物技术，德国弗赖堡聚偏氟乙烯（PVDF）膜 Millipore公司，位于Eschborn，德国的Immobilon – P 半干转移设备例如，来自Bio – Rad，德国慕尼黑硅管（直径3至5毫米，长1米） NeoLab，德国海德堡三。配方的表： 号 缓冲器和解决方案 内容 评论 1 磷酸盐缓冲液（PBS） NA 2 HPO 4 8.1 mMKH 2 PO 4 1.5毫米氯化钠138毫米氯化钾2.7毫米如果前比较正确的解决方案应该是pH值7.4。 2 BN -裂解液 相应的缓冲区 二 – 三20毫米 ε-氨基己酸500毫米氯化钠20毫米 EDTA，pH值8.0 2毫米甘油10％ 用HCl调节pH至7.0。保存在4 ° C。 洗涤剂 毛地黄皂苷0.5至1.0％ 或Brij 96 0.1至0.5％ 或Triton X – 100 0.1〜0.5％ 或Dodecylmaltoside 0.1％至0.5％ 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 抑肽酶10微克/毫升亮肽素10微克/毫升 PMSF 1毫米氟化钠0.5毫米钒酸钠0.5毫米适当的清洁剂，必须凭经验确定，并应在其他裂解液配方中使用的相同。 毛地黄皂苷必须加上之前从DH 2 O（存储在5毫升分装在-20 ° C）的2％原液使用。 使用前应加入蛋白酶和phophatase抑制，口服补液盐。 当钠orthova nadate此外，该缓冲区会变得颜色偏黄。 3 BN透析缓冲器 相应的缓冲区 二 – 三20毫米 ε-氨基己酸500毫米氯化钠20毫米 EDTA，pH值8.0 2毫米甘油10％ 用HCl调节pH至7.0。保存在4 ° C。 洗涤剂 毛地黄皂苷0.3％至0.5％ 或Triton X – 100 0.1％ 或Brij 96 0.1％ 或Dodecylmaltoside 0.1％ 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 PMSF 1毫米钒酸钠0.5毫米适当的清洁剂，必须凭经验确定，并应在其他裂解缓冲液中使用的相同，但表示在低浓度的。 洗涤剂必须添加到预泄聚集在凝胶电泳的堆叠步骤。 使用前应加入蛋白酶和phophatase抑制，口服补液盐。 4 3倍的BN -胶缓冲液双 – 三150毫米 ε-氨基己酸200毫米用HCl调节pH至7.0。保存在4 ° C。 5 4％，分离胶 3倍的BN -胶缓冲液（配方4）5.00毫升丙烯酰胺/双丙烯酰胺1.50毫升 生署2 O 8.50毫升黄芪多糖，在卫生署2 O 54μL的10％ TEMED 5.4微升加入APS和TEMED immedia – tely浇筑前凝胶，这些试剂促进聚合。 这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。 6 15％的分离胶 3倍的BN -胶缓冲液（配方4）5.00毫升丙烯酰胺/双丙烯酰胺5.63毫升甘油70％，4.38毫升黄芪多糖，在卫生署2 O 42μL的10％ TEMED 4.2微升加入APS和TEMED immedia – tely浇筑前凝胶，这些试剂促进聚合。 这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。 丙烯酰胺，双丙烯酰胺的浓度也可以多种多样，从10％至18％的必要。 7 3.2％的浓缩胶 3倍的BN -胶缓冲液（配方4）3.00毫升丙烯酰胺/双丙烯酰胺0.72毫升 生署2 O 5.28毫升黄芪多糖，在卫生署2 120μL，10％ TEMED 12微升加入APS和TEMED immedia – tely浇筑前凝胶，这些试剂促进聚合。 这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。 8 阴极缓冲二 – 三15毫米甘氨酸50毫米考马斯亮蓝G250 0.02％ 准备1公升为10倍的股票，调整pH至7.0，用HCl，并储存在4 ° C。 使用前，应与卫生署2稀释的1:10。 不要代替其他类型考马斯染料，如考马斯亮蓝R250或胶体考​​马斯亮蓝调。 9 阳极缓冲二 – 三50毫米准备1公升为10倍的股票，调整pH至7.0，用HCl，并储存在4 ° C。 使用前，应与卫生署2稀释的1:10。 10 标记混合醛缩酶（158 KD）10毫克/毫升过氧化氢酶（232 KD）10毫克/毫升铁蛋白（440和880 KD）10毫克/毫升甲状腺球蛋白（670 KD）10毫克/毫升 BSA（66和132 KD）10毫克/毫升二 – 三20毫米氯化钠20毫米甘油10％ 用HCl调节pH至7.0。保存在4 ° C。 分子量标记也从几个来源，其中包括的体外根或法玛西亚市售。 11 SDS样品缓冲液三12.5毫米 SDS的4％ 甘油20％ 溴酚蓝0.02％ 调节pH值至6.8。为了减少二硫键，加9毫升β-巯基乙醇。 作为一个粉和β- MER – captoethanol SDS是有毒的。因此，使用手套和引擎盖下工作。 12 4X降低缓冲区三1.5米 SDS的0.4％ 调节pH值至8.8。 SDS的粉末是有毒的。因此，使用手套和引擎盖下工作。 13 4X上层缓冲区三0.5 M SDS的0.4％ 调节pH值至6.8。 SDS的粉末是有毒的。因此，使用手套和引擎盖下工作。 14 10％分离胶丙烯酰胺（30％）2.0毫升 4X较低的缓冲液1.5毫升 生署2 O 2.454毫升黄芪多糖，在卫生署2 O 40μL的10 ％ TEMED 6微升加入APS和TEMED immedia – tely浇筑前凝胶，这些试剂促进聚合。 这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。 15 4.8％的浓缩胶酰胺（30％）320μL， 4X上层缓冲液500μL 生署2 O 1.16毫升 APS的，卫生署2的10％：20 μL TEMED 2微升加入APS和TEMED immedia – tely浇筑前凝胶，这些试剂促进聚合。 这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。 16 半干转移缓冲器三48毫米甘氨酸39毫米甲醇20％ SDS的0.1％ 音量调整到1升，与DH 2 O在室温下储存。 粉末和甲醇SDS是有毒的。因此，使用手套和引擎盖下工作。